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  • 高效液相色谱仪理论常识

    中国教育装备采购网 2006/6/26 15:25:08 围观27675次 我要分享

      被分离组分在柱中的洗脱原理

      Ⅱ 基本概念和理论

      一、基本概念和术语

      1.色谱图和峰参数

      ⊕色谱图(chromatogram)--样品流经色谱柱和检测器,所得到的信号-时间曲线,又称色谱流出曲线(elution profile).

      ⊕基线(base line)--流动相冲洗,柱与流动相达到平衡后,检测器测出一段时间的流出曲线。一般应平行于时间轴。

      ⊕噪音(noise)――基线信号的波动。通常因电源接触不良或瞬时过载、检测器不稳定、流动相含有气泡或色谱柱被污染所致。

      ⊕漂移(drift)基线随时间的缓缓变化。主要由于操作条件如电压、温度、流动相及流量的不稳定所引起,柱内的污染物或固定相不断被洗脱下来也会产生漂移。

      ⊕色谱峰(peak)--组分流经检测器时相应的连续信号产生的曲线。流出曲线上的突起部分。正常色谱峰近似于对称性正态分布曲线(高斯Gauss曲线)。不对称色谱峰有两种:前延峰(leading peak)和脱尾峰(tailing peak ).前者少见。

      ⊕拖尾因子(tailing factor,T)--T=B/A,用以衡量色谱峰的对称性。也称为对称因子(symmetry factor)或不对称因子(asymmetry factor)《中国药典》规定T应为0.95~1.05。T<0.95为前延峰,T>1.05为拖尾峰。

      ⊕峰底――基线上峰的起点至终点的距离。

      ⊕峰高(Peak height,h)――峰的最高点至峰底的距离。

      ⊕峰宽(peak width,W)--峰两侧拐点处所作两条切线与基线的两个交点间的距离。W=4σ。

      ⊕半峰宽(peak width at half-height,Wh/2)--峰高一半处的峰宽。W h/2=2.355σ。

      ⊕标准偏差(standard deviation, σ)--正态分布曲线x=±1时(拐点)的峰宽之半。正常峰宽的拐点在峰高的0.607倍处。标准偏差的大小说明组分在流出色谱柱过程中的分散程度。σ小,分散程度小、极点浓度高、峰形瘦、柱效高;反之,σ大,峰形胖、柱效低。

      ⊕峰面积(peak area,A)――峰与峰底所包围的面积。A=×σ×h=2.507σh=1.064Wh/2h

      2.定性参数(保留值)

      ⊕死时间(dead time,t0)--不保留组分的保留时间。即流动相(溶剂)通过色谱柱的时间。在反相HPLC中可用苯磺酸钠来测定死时间。

      ⊕死体积(dead volume,V0)――由进样器进样口到检测器流动池未被固定相所占据的空间。它包括4部分:进样器至色谱柱管路体积、柱内固定相颗粒间隙(被流动相占据,Vm)、柱出口管路体积、检测器流动池体积。其中只有Vm参与色谱平衡过程,其他3部粉只起峰扩展作用。为防止峰扩展,这3部分体积应尽量减小。V0=F×t0(F为流速)

      ⊕保留时间(retention time,tR)--从进样开始到某个组分在柱后出现浓度极大值的时间。

      ⊕保留体积(retention volume,VR)--从进样开始到某个组分在柱后出现浓度极大值时流出溶剂的体积。又称洗脱体积。VR=F*tR .

      ⊕调整保留时间(adjusted retention time,tR’)--扣除死时间后的保留时间。也称折合保留时间(reduced retention time)。在实验条件(温度、固定相等)一定时,tR’只决定于组分的性质,因此,tR’(或tR)可用于定性。TR’=tR-t0

      ⊕调整保留体积(adjusted retention volume,VR’)--扣除死体积后的保留体积。VR=VR-V0 或VR=F*tR’

      3.柱效参数

      ⊕理论塔板数(theoretical plate number,N)用于定量表示色谱柱的分离效率(简称柱效)。

      N取决于固定相的种类、性质(粒度、粒径分布等)、填充状况、柱长、流动相的种类和流速及测定柱效所用物质的性质。如果峰形对称并符合正态分布,N可近似表示为:

      N=(tR/σ)2=16(tR)2/W =5.54(tR/W1/2)2

      W:峰宽 ; σ:曲线拐点处峰宽的一半,即峰高0.607处峰宽的一半。

      N为常量时,W随tR成正比例变化。在一张多组分色谱图上,如果各组份含量相当,则后洗脱的峰比前面的峰要逐渐加宽,峰高则逐渐降低。

      用半峰宽计算理论塔板数比用峰宽计算更为方便和常用,因为半峰宽更容易准确测定,尤其是对稍有拖尾的峰。

      N与柱长成正比,柱越长,N越大。用N表示柱效时应注明柱长,,如果未注明,则表示柱长为1米时的理论塔板数。(一般HPLC柱的N在1000以上。)

      若用调整保留时间(tR’)计算理论塔板数,所得值称为有效理论塔板数(N有效或Neff)=16(tR’/W)2

      ⊕理论塔板高度(theortical plate height,H)每单位柱长的方差。H=。实际应用时往往用柱长L和理论塔板数计算:H=L/N

      4.相平衡参数(distribution coefficient,K)--在一定温度下,化合物在两相间达到分配平衡时,在固定相与流动相中的浓度之比。K=[xs]/[xm]

      Cs-溶质在固定相中的浓度

      Cm-溶剂在流动相中的浓度

      分配系数与组分、流动相和固定相的热力学性质有关,也与温度、压力有关。在不同的色谱分离机制中,K有不同的概念:吸附色谱法为吸附系数,离子交换色谱法为选择性系数(或称交换系数),凝胶色谱法为滲透参数。但一般情况可用分配系数来表示。

      在条件(流动相、固定相、温度和压力等)一定,样品浓度很低时(Cs 、Cm很小)时,K只取决于组分的性质,而与浓度无关。这只是理想状态下的色谱条件,在这种条件下,得到的色谱峰为正常峰;在许多情况下,随着浓度的增大,K减少,这时色谱峰为拖尾峰;而有时随着溶质浓度的增大,K也增大,这时色谱峰为前延峰。因此,只有尽可能较少进样量,使组份在柱内浓度降低,K恒定时,才能获得正常峰。

      在同一色谱条件下,样品中K值大的组份在固定相中滞留时间长,后流出色谱柱;K值小的组份则滞留时间短,先流出色谱柱。混合物中各组份的分配系数相差越大,越容易分离,因此,混合物中各组份的分配系数不同是色谱分离的前提。

      在HPLC中,固定相确定后,K主要受流动相的性质影响。实践中主要靠调整流动相的组成配比及PH值,以获得组分间的分配系数差异及适宜的保留时间,达到分离的目的。

      ⊕容量因子(capacity factor,K)--化合物在两相间达到平衡时,在固定相与流动相中的量之比。K=(tR-t0)/t0=tR’/t0(或溶质在固定相中的量/溶质在流动相中的量)。因此,容量因子也称质量分配系数。

      {K=Cs/Cm=K’Vm/Vs k=(tR-t0)/t0=K*Vs/Vm Vs:色谱柱中固定相的体积; Vm:色谱柱中流动相的体积。}

      分配系数、容量因子与保留时间之间有如下关系:k===K=,tR’=kt0。上式说明容量因子的物理意义:表示一个组份在固定相中停留的时间(tR’)是不保留组分保留时间(t0)的几倍。k=0时,化合物全部存在与流动相中,在固定相中不保留,tR’=0;k越大,说明固定相对此组分的容量越大,出柱慢,保留时间越长。

      容量因子与分配系数的不同点是:K取决于组分、流动相、固定相的性质及温度,而与体积Vs、Vm无关;k除了与性质及温度有关外,还与Vs、Vm有关。由于tR’、t0较Vs、Vm易于测定,所以容量因子比分配系数应用更广泛。

      ⊕选择性因子(selectivity factor,α)--相邻两组份的分配系数或容量因子之比。α==(设k2>k1)。因k=tR’/t0,则α=k2/k1,所以α又称为相对保留时间(《美国药典》)。

      要使两组分得到分离,必须使α≠1。α与化合物在固定相和流动相中的分配性质、柱温有关,与柱尺寸、流速、填充情况无关。从本质上来说,α的大小表示两组份在两相间的平衡分配热力学性质的差异,即分子间相互作用力的差异。

      5.分离参数

      ⊕分离度(resolution,R)--相邻两峰的保留时间之差与平均峰宽的比值。也叫分辨率,表示相邻两峰的分离程度。R=(tR2-tR1)/[(W1

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