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    从蜡块中提取DNA

    中国教育装备采购网2009-11-09 08:35围观356次我要分享我要投稿

    从蜡块中提取DNA

    需要提醒特别注意的是,石蜡包埋标本由于福尔马林固定和热蜡的包埋,提取的DNA片断会有碎裂,而且很难长期稳定保存,最好提取之后马上扩增或者做相应的实验,在-20度保存一个礼拜以上,DNA就会出现明显的降解,再久就会什么也做不出来。

    1 石蜡包埋组织10um厚切片三张放入EP管。
    2 每管加入二甲苯1ml,盖紧,静置30分钟,12000rpm离心15分钟,吸走弃去二甲苯,保存沉渣。
    3 重复2步骤两遍。
    4 0.5ml无水乙醇,翻转混匀沉渣5分钟,12000rpm离心15分钟,吸走弃去无水乙醇,保存沉渣。
    5 重复4步骤1遍。
    6 真空吸干乙醇,或风干。
    7 向干燥样品中加入200ul消化液(终浓度Tris-Hcl0.05mM,EDTA0.o1mM,Tween20占0.5%,蛋白酶k100ug/ul),混匀沉渣与消化液,55度水浴3小时或者37度过夜,期间最好有摇床,或每隔10分钟手动摇匀。
    8 100度10分钟,灭活蛋白酶k。
    9 短暂离心,沉降管壁上和管盖的水分。
    10 加入与消化液等体积的重蒸苯酚,轻柔颠倒5分钟。4000rpm离心5分钟,小心汲取上清,弃去中间白色沉淀和下清(白色沉淀务必不能吸上来,很关键!)
    11 加入消化液一半体积的重蒸苯酚,一半体积的24:1氯仿:异戊醇,轻柔颠倒5分钟。4000rpm离心5分钟,小心汲取上清,弃去中间白色沉淀和下清(白色沉淀处理同步骤10!)
    12 加入与消化液等体积的24:1氯仿:异戊醇,轻柔颠倒5分钟。4000rpm离心5分钟,小心汲取上清,弃去中间白色沉淀和下清(白色沉淀处理同步骤10!)
    13 上清中加入2倍消化液体积的冰冷无水乙醇(-20度预冷半小时),沉淀1小时以上。
    14 12000rpm4度离心15分钟,弃乙醇,真空吸干,TE30ul溶解沉淀。

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