大鼠S100B蛋白(S100B)ELISA试剂盒使用说明书_中国教育装备采购网
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  • 大鼠S100B蛋白(S100B)ELISA试剂盒使用说明书

    中国教育装备采购网 2010/3/16 14:46:20 围观135次 我要分享

    大鼠 S100B 蛋白 (S100B) ELISA 试剂盒使用说明书

    本试剂盒仅供研究使用

    检测范围: 312 pg/ml - 20000 pg/ml

    最低检测限: 78 pg/ml

    特异性:本试剂盒可同时检测天然或重组的大鼠 S100B ,且与其他相关蛋白无交叉反应。

    有效期: 6 个月

    预期应用: ELISA 法定量测定大鼠血清、血浆、细胞培养上清或其它相关生物液体中 S100B 含量。

    说明

    1 .试剂盒保存: -20 ℃ (较长时间不用时); 2-8℃ (频繁使用时)。

    2 .浓洗涤液低温保存会有盐析出,稀释时可在水浴中加温助溶。

    3 .中、英文说明书可能会有不一致之处,请以英文说明书为准。

    4 .刚开启的酶联板孔中可能会含有少许水样物质,此为正常现象,不会对实验结果造成任何影响。

    实验原理

    用纯化的抗体包被微孔板,制成固相载体,往包被抗 S100B 抗体的微孔中依次加入标本或标准品、生物素化的抗 S100B 抗体、 HRP 标记的亲和素,经过彻底洗涤后用底物 TMB 显色。 TMB 在过氧化物酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的 S100B 呈正相关。用酶标仪在 450nm 波长下测定吸光度( OD 值),计算样品浓度。

    试剂盒组成及试剂配制

    1. 1.         酶联板 (Assay plate ) :一块( 96 孔)。
    2. 2.         标准品 Standard ): 2 瓶 ( 冻干品 ) 。
    3. 3.         样品稀释液 (Sample Diluent ) : 1×20ml/ 瓶。
    4. 4.         生物素标记抗体稀释液( Biotin-antibody Diluent : 1×10ml/ 瓶。
    5. 5.         辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液   ( HRP-avidin Diluent : 1×10ml/ 瓶。
    6. 6.         生物素标记抗体( Biotin-antibody : 1×120μl/ 瓶( 1 : 100 )
    7. 7.         辣根过氧化物酶标记亲和素( HRP-avidin : 1×120μl/ 瓶( 1 : 100 )
    8. 8.         底物溶液( TMB Substrate : 1×10ml/ 瓶。
    9. 9.         浓洗涤液( Wash Buffer : 1×20ml/ 瓶,使用时每瓶用蒸馏水稀释 25 倍。
    10. 10.     终止液( Stop Solution : 1×10ml/ 瓶( 2N H2SO4 )。

     

    需要而未提供的试剂和器材

    1. 1.         标准规格酶标仪
    2. 2.         高速离心机
    3. 3.         电热恒温培养箱
    4. 4.         干净的试管和 Eppendof 管
    5. 5.         系列可调节移液器及吸头,一次检测样品较多时,最好用多通道移液器

    6.    蒸馏水,容量瓶等

    标本的采集及保存

    1. 1.         血清:全血标本请于室温放置 2 小时或 4 ℃ 过夜后于 1000g 离心 20 分钟,取上清即可检测,或将标本放于 -20 ℃ 或 -80 ℃ 保存,但应避免反复冻融。
    2. 2.         血浆:可用EDTA或肝素作为抗凝剂,标本采集后30分钟内于 2 - 8°C 1000 g 离心 15 分钟,或将标本放于 -20 ℃ 或 -80 ℃ 保存,但应避免反复冻融。
    3. 3.         细胞培养物上清或其它生物标本: 1000g 离心 20 分钟,取上清即可检测,或将标本放于 -20 ℃ 或 -80 ℃ 保存,但应避免反复冻融。

    注:标本溶血会影响最后检测结果,因此溶血标本不宜进行此项检测。

    标本的稀释原则:

    首先通过文献检索的方式了解待测样本的大致含量,确定适当的稀释倍数。只有稀释至标准曲线的范围内,检测的结果才是准确的。稀释的过程中,应做好详细的记录。最后计算浓度时,稀释了 “N” 倍,标本的浓度应再乘以 “N” 。

    标准品的稀释原则: 2 瓶,每瓶临用前以样品稀释液稀释至 1ml ,盖好后静置 10 分钟以上,然后反复颠倒 / 搓动以助溶解,其浓度为 20000 pg/ml ,做系列倍比稀释后,分别稀释 20000 pg/ml , 10000 pg/ml , 5000 pg/ml , 2500 pg/ml , 1250 pg/ml , 625 pg/ml , 312 pg/ml ,样品稀释液直接作为标准浓度 0 pg/ml ,临用前 15 分钟内配制。

    如配制 10000 pg/ml 标准品:取 0.5ml (不要少于 0.5ml ) 20000 pg/ml 的上述标准品加入含 0.5ml 样品稀释液的 Eppendorf 管中,混匀即可,其余浓度以此类推。

    生物素标记抗体的稀释原则:

    临用前以生物素标记抗体稀释液稀释,稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制(每孔 100μl ),实际配制时应多配制 0.1-0.2ml 。如 10μl 生物素标记抗体加 990μl 生物素标记抗体稀释液的比例配制,轻轻混匀,在使用前一小时内配制。

    辣根过氧化物酶标记亲和素的稀释原则:

    临用前以辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液稀释,稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制(每孔 100μl ),实际配制时应多配制 0.1-0.2ml 。如 10μl 辣根过氧化物酶标记亲和素加 990μl 辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液   的比例配制,轻轻混匀,在使用前一小时内配制。

    操作步骤

    实验开始前,请提前配置好所有试剂,试剂或样品稀释时,均需混匀,混匀时尽量避免起泡。每次检测都应该做标准曲线。如样品浓度过高时,用样品稀释液进行稀释,以使样品符合试剂盒的检测范围。

    1. 1.         加样:分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液 100μl ,余孔分别加标准品或待测样品 100 μl ,注意不要有气泡,加样将样品加于酶标板孔底部,尽量不触及孔壁,轻轻晃动混匀,酶标板加上盖或覆膜, 37℃ 反应 120 分钟。

    为保证实验结果有效性,每次实验请使用新的标准品溶液。

    1. 2.         弃去液体,甩干,不用洗涤。每孔加生物素标记抗体工作液 100μl (取 1μl 生物素标记抗体加 99μl 生物素标记抗体稀释液的比例配制,轻轻混匀,在使用前一小时内配制), 37℃,60 分钟。
    2. 3.         温育 60 分钟后,弃去孔内液体,甩干,洗板 3 次,每次浸泡 1-2 分钟, 200μl/ 每孔,甩干。
    3. 4.         每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素工作液(同生物素标记抗体工作液) 100μl , 37℃ , 60 分钟。
    4. 5.         温育 60 分钟后,弃去孔内液体,甩干,洗板 5 次,每次浸泡 1-2 分钟, 200μl/ 每孔,甩干。
    5. 6.         依序每孔加底物溶液 90μl , 37℃ 避光显色 30 分钟内,此时肉眼可见标准品的前 3-4 孔有明显的梯度蓝色,后 3-4 孔显色不明显,即可终止)。
    6. 7.         依序每孔加终止溶液 50μl ,终止反应(此时蓝色立转黄色)。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。为了保证实验结果的准确性,底物反应时间到后应尽快加入终止液。
    7. 8.         用酶联仪在 450nm 波长依序测量各孔的光密度( OD 值)。 在加终止液后 15 分钟以内进行检测。

    1. 用户在初次使用试剂盒时,应将各种试剂管离心数分钟,以便试剂集中到管底。

    2. 每次实验留一孔作为空白调零孔,该孔不加任何试剂,只是最后加底物溶液及 2N H2SO4 。测量时先用此孔调 OD 值至零。

    3. 为防止样品蒸发,试验时将反应板放于铺有湿布的密闭盒内,酶标板加上盖或覆膜。

    4. 未使用完的酶标板或者试剂,请于 2-8℃ 保存。标准品、生物素标记抗体工作液、辣根过氧化物酶标记亲和素工作液请依据所需的量配置使用。请勿重复使用已稀释过的标准品、生物素标记抗体工作液、或辣根过氧化物酶标记亲和素工作液。

    5. 建议检测样品时均设双孔测定,以保证检测结果的准确性。

    洗板方法
    手工洗板方法:吸去(不可触及板壁)或甩掉酶标板内的液体;在实验台上铺垫几层吸水纸,酶标板朝下用力拍几次;将推荐的洗涤缓冲液至少 0.3ml 注入孔内,浸泡 1-2 分钟。根据需要,重复此过程数次。
    自动洗板:如果有自动洗板机,应在熟练使用后再用到正式实验过程中。

    计算

    以标准物的浓度为横坐标(对数坐标), OD 值为纵坐标(普通坐标),在半对数坐标纸上绘出标准曲线,根据样品的 OD 值由标准曲线查出相应的浓度;再乘以稀释倍数;或用标准物的浓度与 OD 值计算出标准曲线的直线回归方程式,将样品的 OD 值代入方程式,计算出样品浓度,再乘以稀释倍数,即为样品的实际浓度。

    注意事项

    1. 当混合蛋白溶液时应尽量轻缓,避免起泡。

    2. 洗涤过程非常重要,不充分的洗涤易造成假阳性。

    3. 一次加样时间最好控制在 5 分钟内,如标本数量多,推荐使用排枪加样。

    4. 请每次测定的同时做标准曲线,最好做复孔。

    5. 如标本中待测物质含量过高,请先稀释后再测定,计算时请最后乘以稀释倍数。

    6. 在配制标准品、检测溶液工作液时,请以相应的稀释液配制,不能混淆。

    7. 底物请避光保存。

    8. 不要用其它生产厂家的试剂替换试剂盒中的试剂。

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