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  • 人胰蛋白酶原激活肽(TAP)ELISA试剂盒说明书

    中国教育装备采购网2010-09-06 12:01围观27次我要分享

    人胰蛋白酶原激活肽(TAP)ELISA试剂盒说明书

    本试剂盒仅供研究使用                                       

    预期应用

    ELISA法定量测定人血清、血浆或其它相关液体中胰蛋白酶原激活肽(TAP)含量。

    实验原理

    本试剂盒应用双抗体夹心酶标免疫分析法测定标本中MBP水平。用纯化的抗体包被微孔板,制成固相抗体,往包被单抗的微孔中依次加入TAP抗原、生物素化的抗人TAP抗体、HRP标记的亲和素,经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的TAP呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值),计算样品浓度。

    试剂盒组成及试剂配制

    1.         酶联板:一块(96孔)

    标准品(冻干品):2瓶,每瓶临用前以样品稀释液稀释至1ml,盖好后静置10分钟以上,然后反复颠倒/搓动以助溶解,其浓度为50 nmol/ml,做系列倍比稀释后,分别稀释成50 nmol/ml ,25 nmol/ml,12.5 nmol/ml,6.25 nmol/ml,3.12 nmol/ml,1.56 nmol/ml,0.78 nmol/ml,样品稀释液直接作为标准浓度0 nmol/ml,临用前15分钟内配制。

    如配制25 nmol/ml标准品:取0.5ml 50 nmol/ml的上述标准品加入含有0.5ml样品稀释液的Eppendorf管中,混匀即可,其余浓度以此类推。

    2.         样品稀释液:1×20ml/瓶。

    3.         检测稀释液A:1×10ml/瓶。

    4.         检测稀释液B:1×10ml/瓶。

    5.         检测溶液A:1×120ul/瓶(1:100)临用前以检测稀释液A 1:100稀释,稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制(每孔100ul),实际配制时应多配制0.1-0.2ml。如1ul检测溶液A加99ul检测稀释液A的比例配制,轻轻混匀,在使用前一小时内配制。

    6.         检测溶液B:1×120ul/瓶(1:100)临用前以检测稀释液B1:100稀释。稀释方法同检测溶液A。

    7.         底物溶液:1×10ml/瓶。

    8.         浓洗涤液:1×30ml/瓶,使用时每瓶用蒸馏水稀释25倍。

    9.         终止液:1×10ml/瓶(2N H2SO4)。

    标本的采集及保存

    1.血清:标本请于室温放置2小时或4℃过夜后于1000 x g离心20分钟,取上清即可检测,或将标本放于-20℃保存,但应避免反复冻融。

    2.血浆:可用EDTA或肝素作为抗凝剂,标本采集后30分钟内于2 - 8° C 1000 x g离心15分钟,或将标本放于-20℃保存,但应避免反复冻融。

    注:标本溶血会影响最后检测结果,因此溶血标本不宜进行此项检测。

    操作步骤

    实验开始前,请提前配置好所有试剂,试剂或样品稀释时,均需混匀,混匀时尽量避免起泡。每次检测都应该做标准曲线。如样品浓度过高时,用样品稀释液进行稀释,以使样品符合试剂盒的检测范围。

    1.         加样:分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100ul,余孔分别加标准品或待测样品100ul,注意不要有气泡,加样将样品加于酶标板孔底部,尽量不触及孔壁,轻轻晃动混匀,酶标板加上盖或覆膜,37℃反应120分钟。

    为保证实验结果有效性,每次实验请使用新的标准品溶液。

    2.         弃去液体,甩干,不用洗涤。每孔加检测溶液A工作液 100ul(取1ul检测溶液A加99ul检测稀释液A的比例配制,轻轻混匀,在使用前一小时内配制),37℃,60分钟。

    3.         温育60分钟后,弃去孔内液体,甩干,洗板3次,每次浸泡1-2分钟,350ul/每孔,甩干。

    4.         每孔加检测溶液B工作液(同检测A工作液) 100ul,37℃,60分钟。

    5.         温育60分钟后,弃去孔内液体,甩干,洗板5次,每次浸泡1-2分钟,350ul/每孔,甩干。

    6.         依序每孔加底物溶液90ul,37℃避光显色(30分钟内,此时肉眼可见标准品的前3-4孔有明显的梯度兰色,后3-4孔梯度不明显,即可终止)。

    7.         依序每孔加终止溶液50ul,终止反应(此时蓝色立转黄色)。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。为了保证实验结果的准确性,底物反应时间到后应尽快加入终止液。

    8.         用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度(OD值)。 在加终止液后15分钟以内进行检测。

    1. 每次实验留一孔作为空白调零孔,该孔不加任何试剂,只是最后加底物溶液及2NH2SO4。测量时先用此孔调OD值至零。

    2.为防止样品蒸发,试验时将反应板放于铺有湿布的密闭盒内,酶标板加上盖或覆膜。

    3.  未使用完的酶标板或者试剂,请于2-8℃保存。标准品、检测溶液A工作液、检测溶液B工作液请依据所需的量配置使用。请勿重复使用已稀释过的标准品、检测溶液A工作液或检测溶液B工作液。

    4.  建议检测样品时均设双孔测定,以保证检测结果的准确性。

     

    洗板方法
    手工洗板方法:吸去(不可触及板壁)或甩掉酶标板内的液体;在实验台上铺垫几层

    纸,酶标板朝下用力拍几次;将推荐的洗涤缓冲液至少0.3ml注入孔内,浸泡1-2分钟,根据需

    要,重复此过程数次。
    自动洗板:如果有自动洗板机,应在熟练使用后再用到正式实验过程中。

    特异性

        本试剂盒可同时检测重组或天然的人TAP,且与其它相关蛋白无交叉反应。

    计算

      以标准物的浓度为横坐标(对数坐标),OD值为纵坐标(普通坐标),在半对数坐标纸上绘出标准曲线,根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度;再乘以稀释倍数;或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式,将样品的OD值代入方程式,计算出样品浓度,再乘以稀释倍数,即为样品的实际浓度。

    注意事项

    1.  洗涤过程非常重要,不充分的洗涤易造成假阳性。

    2.  一次加样时间最好控制在5分钟内,如标本数量多,推荐使用排枪加样。

    3.  请每次测定的同时做标准曲线,最好做复孔。

    4.  如标本中待测物质含量过高,请先稀释后再测定,计算时请最后乘以稀释倍数。

    5.在配制标准品、检测溶液工作液时,请以相应的稀释液配制,不能混淆。

    6.底物请避光保存。

     

    检测范围:

    0.78 nmol/ml -50 nmol/ml

    说明

    1.试剂盒保存:-20℃(较长时间不用时);2-8℃(频繁使用时)。

    2.有效期:6个月

    3.浓洗涤液会有盐析出,稀释时可在水浴中加温助溶。

    4.刚开启的酶联板孔中可能会含有少许水样物质,此为正常现象,不会对实验结果造成任何影响。

    5.中、英文说明书可能会有不一致之处,请以英文说明书为准。

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