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  • 小鼠吡啶交联物(PY)酶联免疫分析试剂盒使用说明书

    中国教育装备采购网2010-09-07 09:50围观35次我要分享我要投稿

    本试剂盒仅供研究使用

    特异性:本试剂盒可同时检测天然或重组的小鼠吡啶交联物(PY),且与其他相关蛋白无交叉反应。
    有效期:6个月
    预期应用:ELISA法定量测定小鼠血清、血浆、细胞培养上清或其它相关生物液体中吡啶交联物(PY)含量。
    说明
    1.试剂盒保存:-20℃(较长时间不用时);2-8℃(频繁使用时)。
    2.浓洗涤液低温保存会有盐析出,稀释时可在水浴中加温助溶。
    3.中、英文说明书可能会有不一致之处,请以英文说明书为准。
    4.刚开启的酶联板孔中可能会含有少许水样物质,此为正常现象,不会对实验结果造成任何影响。

    实验原理
    用纯化的抗体包被微孔板,制成固相载体,往包被抗吡啶交联物(PY)抗体的微孔中依次加入标本或标准品、生物素化的抗吡啶交联物(PY)抗体、HRP标记的亲和素,经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的吡啶交联物(PY)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值),计算样品浓度。
    试剂盒组成及试剂配制
    1. 酶联板(Assay plate ):一块(96孔)。
    2. 标准品(Standard):2瓶(冻干品)。
    3. 样品稀释液(Sample Diluent):1×20ml/瓶。
    4. 生物素标记抗体稀释液(Biotin-antibody Diluent):1×10ml/瓶。
    5. 辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液 (HRP-avidin Diluent):1×10ml/瓶。
    6. 生物素标记抗体(Biotin-antibody):1×120μl/瓶(1:100)
    7. 辣根过氧化物酶标记亲和素(HRP-avidin):1×120μl/瓶(1:100)
    8. 底物溶液(TMB Substrate):1×10ml/瓶。
    9. 浓洗涤液(Wash Buffer):1×20ml/瓶,使用时每瓶用蒸馏水稀释25倍。
    10. 终止液(Stop Solution):1×10ml/瓶(2N H2SO4)。

    需要而未提供的试剂和器材
    1. 标准规格酶标仪
    2. 高速离心机
    3. 电热恒温培养箱
    4. 干净的试管和Eppendof管
    5. 系列可调节移液器及吸头,一次检测样品较多时,最好用多通道移液器
    6. 蒸馏水,容量瓶等
    标本的采集及保存
    1. 血清:全血标本请于室温放置2小时或4℃过夜后于1000g离心20分钟,取上清即可检测,或将标本放于-20℃或-80℃保存,但应避免反复冻融。
    2. 血浆:可用EDTA或肝素作为抗凝剂,标本采集后30分钟内于2 - 8°C 1000 g离心15分钟,或将标本放于-20℃或-80℃保存,但应避免反复冻融。
    3. 细胞培养物上清或其它生物标本:1000g离心20分钟,取上清即可检测,或将标本放于-20℃或-80℃保存,但应避免反复冻融。
    注:标本溶血会影响最后检测结果,因此溶血标本不宜进行此项检测。
    标本的稀释原则:
    首先通过文献检索的方式了解待测样本的大致含量,确定适当的稀释倍数。只有稀释至标准曲线的范围内,检测的结果才是准确的。稀释的过程中,应做好详细的记录。最后计算浓度时,稀释了“N”倍,标本的浓度应再乘以“N”。
    标准品的稀释原则:2瓶,每瓶临用前以样品稀释液稀释至1ml,盖好后静置10分钟以上,然后反复颠倒/搓动以助溶解,其浓度为200 U/ml,做系列倍比稀释后,分别稀释200 U/ml,100 U/ml,50 U/ml,25 U/ml,12.5 U/ml,6.25 U/ml,3.12 U/ml,样品稀释液直接作为标准浓度0 U/ml,临用前15分钟内配制。
    如配制100 U/ml标准品:取0.5ml(不要少于0.5ml)200 U/ml的上述标准品加入含0.5ml样品稀释液的Eppendorf管中,混匀即可,其余浓度以此类推。
    生物素标记抗体的稀释原则:
    临用前以生物素标记抗体稀释液稀释,稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制(每孔100μl),实际配制时应多配制0.1-0.2ml。如10μl生物素标记抗体加990μl生物素标记抗体稀释液的比例配制,轻轻混匀,在使用前一小时内配制。
    辣根过氧化物酶标记亲和素的稀释原则:
    临用前以辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液稀释,稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制(每孔100μl),实际配制时应多配制0.1-0.2ml。如10μl辣根过氧化物酶标记亲和素加990μl辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液 的比例配制,轻轻混匀,在使用前一小时内配制。
    操作步骤
    实验开始前,请提前配置好所有试剂,试剂或样品稀释时,均需混匀,混匀时尽量避免起泡。每次检测都应该做标准曲线。如样品浓度过高时,用样品稀释液进行稀释,以使样品符合试剂盒的检测范围。
    1. 加样:分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100μl,余孔分别加标准品或待测样品100μl,注意不要有气泡,加样将样品加于酶标板孔底部,尽量不触及孔壁,轻轻晃动混匀,酶标板加上盖或覆膜,37℃反应120分钟。
    为保证实验结果有效性,每次实验请使用新的标准品溶液。
    2. 弃去液体,甩干,不用洗涤。每孔加生物素标记抗体工作液 100μl(取1μl生物素标记抗体加99μl生物素标记抗体稀释液的比例配制,轻轻混匀,在使用前一小时内配制),37℃,60分钟。
    3. 温育60分钟后,弃去孔内液体,甩干,洗板3次,每次浸泡1-2分钟,200μl/每孔,甩干。
    4. 每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素工作液(同生物素标记抗体工作液) 100μl,37℃,60分钟。
    5. 温育60分钟后,弃去孔内液体,甩干,洗板5次,每次浸泡1-2分钟,200μl/每孔,甩干。
    6. 依序每孔加底物溶液90μl,37℃避光显色(30分钟内,此时肉眼可见标准品的前3-4孔有明显的梯度蓝色,后3-4孔显色不明显,即可终止)。
    7. 依序每孔加终止溶液50μl,终止反应(此时蓝色立转黄色)。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。为了保证实验结果的准确性,底物反应时间到后应尽快加入终止液。
    8. 用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度(OD值)。 在加终止液后15分钟以内进行检测。
    注:
    1. 用户在初次使用试剂盒时,应将各种试剂管离心数分钟,以便试剂集中到管底。
    2. 每次实验留一孔作为空白调零孔,该孔不加任何试剂,只是最后加底物溶液及2N H2SO4。测量时先用此孔调OD值至零。
    3. 为防止样品蒸发,试验时将反应板放于铺有湿布的密闭盒内,酶标板加上盖或覆膜。
    4. 未使用完的酶标板或者试剂,请于2-8℃保存。标准品、生物素标记抗体工作液、辣根过氧化物酶标记亲和素工作液请依据所需的量配置使用。请勿重复使用已稀释过的标准品、生物素标记抗体工作液、或辣根过氧化物酶标记亲和素工作液。
    5. 建议检测样品时均设双孔测定,以保证检测结果的准确性。
    洗板方法
    手工洗板方法:吸去(不可触及板壁)或甩掉酶标板内的液体;在实验台上铺垫几层吸水纸,酶标板朝下用力拍几次;将推荐的洗涤缓冲液至少0.3ml注入孔内,浸泡1-2分钟。根据需要,重复此过程数次。
    自动洗板:如果有自动洗板机,应在熟练使用后再用到正式实验过程中。
    计算
    以标准物的浓度为横坐标(对数坐标),OD值为纵坐标(普通坐标),在半对数坐标纸上绘出标准曲线,根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度;再乘以稀释倍数;或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式,将样品的OD值代入方程式,计算出样品浓度,再乘以稀释倍数,即为样品的实际浓度。
    注意事项
    1. 当混合蛋白溶液时应尽量轻缓,避免起泡。
    2. 洗涤过程非常重要,不充分的洗涤易造成假阳性。
    3. 一次加样时间最好控制在5分钟内,如标本数量多,推荐使用排枪加样。
    4. 请每次测定的同时做标准曲线,最好做复孔。
    5. 如标本中待测物质含量过高,请先稀释后再测定,计算时请最后乘以稀释倍数。
    6. 在配制标准品、检测溶液工作液时,请以相应的稀释液配制,不能混淆。
    7. 底物请避光保存。
    8. 不要用其它生产厂家的试剂替换试剂盒中的试剂。

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