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  • 人可溶性凝集素样氧化低密度脂蛋白受体1(sLOX-1)酶联免疫吸附测定试剂

    中国教育装备采购网2010-09-07 10:34围观135次我要分享我要投稿

    本试剂盒仅供体外研究使用!
    预期应用
    ELISA法定量测定人血清、血浆或其它相关生物液体中sLOX-1含量。

    实验原理
    用纯化的抗体包被微孔板,制成固相载体,往包被抗  sLOX-1抗体的微孔中依次加入标本或标准品、生物素化的抗  sLOX-1抗体、HRP标记的亲和素,经过彻底洗涤后用底物  TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的 sLOX-1呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度( OD值),计算样品浓度。

    试剂盒组成及试剂配制
    1. 酶联板:一块(96孔)
    2. 标准品(冻干品): 2瓶,每瓶临用前以样品稀释液稀释至0.5 ml,盖好后静置10分钟以上,然后反复颠倒/搓动以助溶解,其浓度为600 pg/ml,做系列倍比稀释(注:不要直接在板中进行倍比稀释)后,分别稀释成600 pg/ml,300 pg/ml,150 pg/ml,75 pg/ml,37.5 pg/ml,18.75 pg/ml,9.38 pg/ml,样品稀释液直接作为标准浓度0 pg/ml,临用前15分钟内配制。如配制300 pg/ml标准品:取0.3ml (不要少于0.3ml )  600 pg/ml的上述标准品加入含有0.3ml样品稀释液的Eppendorf管中,混匀即可,其余浓度以此类推。
    3. 样品稀释液:1×20ml。
    4. 检测稀释液A:1×10ml。
    5. 检测稀释液B:1×10ml。
    6. 检测溶液A:1×120μl(1:100)临用前以检测稀释液A 1:100稀释,稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制(100μl/孔),实际配制时应多配制  0.1-0.2ml。如10μl检测溶液A加990μl检测稀释液A的比例配制,轻轻混匀,在使用前一小时内配制。
    7. 检测溶液B:1×120μl/瓶(1:100)临用前以检测稀释液B 1:100稀释。稀释方法同检测溶液A。
    8. 底物溶液:1×10ml/瓶。
    9. 浓洗涤液:1×30ml/瓶,使用时每瓶用蒸馏水稀释25倍。
    10. 终止液:1×10ml/瓶(2N H2SO4)。
    11. 覆膜:5张
    12. 使用说明书:1份

    自备物品
    1.   酶标仪(建议参考仪器使用说明提前预热)
    2.   微量加液器及吸头,EP管
    3.   蒸馏水或去离子水,全新滤纸

    标本的采集及保存
    1. 血清:全血标本请于室温放置2小时或4℃过夜后于1000 x g离心20分钟,取上清即可检测,或将标本放于-20℃或-80℃保存,但应避免反复冻融。
    2. 血浆:可用EDTA或肝素作为抗凝剂,标本采集后30分钟内于2 - 8° C 1000 x g离心15分钟,或将标本放于-20℃或-80℃保存,但应避免反复冻融。
    3. 其它生物标本:请1000 x g离心20分钟,取上清即可检测,或将标本放于-20℃或-80℃保存,但应避免反复冻融。
    注:以上标本置4℃保存应小于1周,-20℃或-80℃均应密封保存,-20℃不应超过1个月,-80℃不应超过2个月;标本溶血会影响最后检测结果,因此溶血标本不宜进行此项检测。

    操作步骤
    实验开始前,各试剂均应平衡至室温(试剂不能直接在37℃溶解);试  剂或样品稀释时,均需混匀,混匀时尽量避免起泡。实验前应预测样品含量,如样品浓度过高时,应对样品进行稀释,以使稀释后的样品符合试剂盒的检测范围,计算时再乘以相应的稀释倍数。
    1. 加样:分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液 100μl,余孔分别加标准品或待测样品100μl,注意不要有气泡,加样将样品加于酶标板孔底部,尽量不触及孔壁,轻轻晃动混匀,酶标板加上盖或覆膜,37℃反应120分钟。为保证实验结果有效性,每次实验请使用新的标准品溶液。
    2. 弃去液体,甩干,不用洗涤。每孔加  检测溶液A工作液 100μl(在使用前一小时内配制),酶标板加上覆膜,37℃反应60分钟。
    3. 温育60分钟后,弃去孔内液体,甩干,洗板 3次,每次浸泡1-2分钟,大约400μl/每孔,甩干(也可轻拍将孔内液体拍干)。
    4. 每孔加检测溶液B工作液(同检测A工作液) 100μl,酶标板加上覆膜37℃反应60分钟。
    5. 温育60分钟后,弃去孔内液体,甩干,洗板5次,每次浸泡1-2分钟,350μl/每孔,甩干(也可轻拍将孔内液体拍干)。
    6. 依序每孔加底物溶液90μl,酶标板加上覆膜37℃避光显色(30分钟内,此时肉眼可见标准品的前3-4孔有明显的梯度兰色,后3-4孔梯度不明显,即可终止)。
    7. 依序每孔加终止溶液50μl,终止反应,此时蓝色立转黄色。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。为了保证实验结果的准确性,底物反应时间到后应尽快加入终止液。
    8. 用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度(OD值)。 在加终止液后立即进行检测。

    注:
    1.  试剂准备:所有试剂都必须在使用前达到室温,使用后请立即按照说明书要求保存试剂。  实验操作中请使用一次性的吸头,避免交叉污染。
    2.   加样:加样或加试剂时,请注意在吸取标本 / 标准品,酶结合物或底物时,第一个孔与最后一个孔加样之间的时间间隔如果太大,将会导致不同的 “预孵育”时间,从而明显地影响到测量值的准确性及重复性。一次加样时间(包括标准品及所有样品)最好控制在  10分钟内,如标本数量多,推荐使用多道移液器加样。
    3.   孵育:为防止样品蒸发,试验时将反应板放于铺有湿布的密闭盒内,酶标板加上盖或覆膜,以避免液体蒸发;洗板后应尽快进行下步操作,任何时侯都应避免酶标板处于干燥状态;同时应严格遵守给定的孵育时间和温度。
    4.   洗涤:洗涤过程中反应孔中残留的洗涤液应在滤纸上充分拍干,勿将滤纸直接放入反应孔中吸水,同时要消除板底残留的液体和手指印,避免影响最后的酶 标仪读数。
    5.  试剂配制:Detection A及Detection B在使用前请手甩几下或少时离心处理,以使管壁或瓶盖的液体沉积到管底。标准品、检测溶液A工作液、检测溶液B工作液请依据所需的量配置使用,并使用相应的稀释液配制,不能混淆。请精确配置标准品及工作液,尽量不要微量配置(如吸取检测溶液A时,一次不要小于10μl),以避免由于不准确稀释而造成的浓度误差;请勿重复使用已稀释过的标准品、检测溶液A工作液或检测溶液B工作液。
    6.  反应时间的控制:加入底物后请定时观察反应孔的颜色变化(比如,每隔10分钟),如颜色较深,请提前加入终止液终止反应,避免反应过强从而影响酶标仪光密度读数。
    7.  底物:底物请避光保存,在储存和温育时避免强光直接照射。
        建议检测样品时均设双孔测定,以保证检测结果的准确性。
        如标本中待测物质含量过高,请先稀释后再测定,计算时请最后乘以稀释倍数。

    洗板方法
    1.  手工洗板方法:吸去(不可触及板壁)或甩掉酶标板内的液体;在实验台上铺垫几层吸水纸,酶标板朝下用力拍几次;将推荐的洗涤缓冲液至少0.3ml注入孔内,浸泡1-2分钟,根据需要,重复此过程数次。
    2.  自动洗板:如果有自动洗板机,应在熟练使用后再用到正式实验过程中。

    特异性
        本试剂盒可同时检测重组或天然的人sLOX-1,且与其它相关蛋白无交叉反应。

    计算
      以标准物的浓度为纵坐标(对数坐标), OD值为横坐标(对数坐标),在对数坐标纸上绘出标准曲线。推荐使用专业制作曲线软件进行分析,如 curve expert 1.3,根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度,再乘以稀释倍数;或用标准物的浓度与 OD值计算出标准曲线的回归方程式,将样品的OD值代入方程式,计算出样品浓度,再乘以稀释倍数,即为样品的实际浓度。

    检测范围:9.38 pg/ml - 600 pg/ml

    最低检测限:2.4 pg/ml

    说明
    1. 在储存及孵育过程中避免将试剂暴露在强光中。所有试剂瓶盖须盖紧以防止蒸发和污染,试剂避免受到微生物的污染,因为蛋白水解酶的干扰将导致出现错误的结果。
    2. 小心吸取试剂并严格遵守给定的孵育时间和温度。请注意在吸取标本 / 标准品,酶结合物或底物时,第一个孔与最后一个孔加样之间的时间间隔如果太大,将会导致不同的 “预孵育”时间,从而明显地影响到测量值的准确性及重复性。而且,洗涤不充分将影响试验结果。
    3. 试剂盒保存:部分试剂保存于-20℃,部分试剂保存于2-8℃,具体以标签上的标示为准。
    4. 浓洗涤液会有盐析出,稀释时可在水浴中加温助溶。
    5. 刚开启的酶联板孔中可能会含有少许水样物质,此为正常现象,不会对实验结果造成任何影响。
    6. 中、英文说明书可能会有不一致之处,请以英文说明书为准。
    7. 所有的样品都应管理好,按照规定的程序处理样品和检测装置。
    8. 有效期:6个月

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