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  • 人α-辅肌动蛋白3(ACTN-3)酶联免疫吸附测定试剂盒使用说明书

    中国教育装备采购网 2010/11/10 8:56:24 围观72次 我要分享

    本试剂盒仅供研究使用
     
    预期应用
    ELISA法定量测定人血浆,血清或其它相关液体中ACTN-3含量。
    实验原理
    本试剂盒应用双抗体夹心酶标免疫分析法测定标本中ACTN-3水平。用纯化的抗体包被微孔板,制成固相抗体,往包被单抗的微孔中依次加入ACTN-3、生物素化的抗ACTN-3抗体、HRP标记的亲和素,经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的ACTN-3呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值),计算样品浓度。
    试剂盒组成及试剂配制
    1. 酶联板:一块(96孔)
    2. 标准品(冻干品):2瓶,每瓶临用前以样品稀释液稀释至1ml,盖好后静置10分钟以上,然后反复颠倒/搓动以助溶解,其浓度为10 mg/L,做系列倍比稀释后,分别稀释成10 mg/L, 5 mg/L ,2.5 mg/L,1.25 mg/L,0.62 mg/L,0.31 mg/L,0.15 mg/L,,其原液直接作为最高标准浓度,样品稀释液直接作为标准浓度0 mg/L,临用前15分钟内配制。
    如配制10 mg/L标准品:取0.5ml 20 mg/L的上述标准品加入含有0.5ml样品稀释液的Eppendorf管中,混匀即可,其余浓度以此类推。
    3. 样品稀释液:1×20ml/瓶。
    4. 检测稀释液A:1×10ml/瓶。
    5. 检测稀释液B:1×10ml/瓶。
    6. 检测溶液A:1×120ul/瓶(1:100)临用前以检测稀释液A 1:100稀释,稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制(每孔100ul),实际配制时应多配制0.1-0.2ml。如1ul检测溶液A加99ul检测稀释液A的比例配制,轻轻混匀,在使用前一小时内配制。
    7. 检测溶液B:1×120ul/瓶(1:100)临用前以检测稀释液B1:100稀释。稀释方法同检测溶液A。
    8. 底物溶液:1×10ml/瓶。
    9. 浓洗涤液:1×30ml/瓶,使用时每瓶用蒸馏水稀释25倍。
    10. 终止液:1×10ml/瓶(2N H2SO4)。
    标本的采集及保存
    1.血清:标本请于室温放置2小时或4℃过夜后于1000 x g离心20分钟,取上清即可检测,或将标本放于-20℃保存,但应避免反复冻融。
    2.血浆:可用EDTA或肝素作为抗凝剂,标本采集后30分钟内于2 - 8° C 1000 x g离心15分钟,或将标本放于-20℃保存,但应避免反复冻融。
    操作步骤
    各试剂在使用前平衡至室温。
    1. 加样:分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。除空白孔外,余孔分别加标准溶液或待测样品100ul,注意不要有气泡,轻轻混匀,酶标板加上盖,37℃反应120分钟。
    2. 弃去液体,甩干,不用洗涤。
    3. 每孔加检测溶液A工作液 100ul,37℃,60分钟。洗板3次,350ul/每孔,甩干。
    4. 每孔加检测溶液B工作液 100ul,37℃,60分钟,洗板5次,甩干。
    5. 依序每孔加底物溶液90ul,37℃避光显色30分钟(此时肉眼可见标准品的前3-4孔有明显的梯度兰色,后3-4孔梯度不明显)。
    6. 依序每孔加终止溶液50ul,终止反应(此时兰色立转黄色)。用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度(OD值)。
    注:
    1. 每次实验留一孔作为空白调零孔,该孔不加任何试剂,只是最后加底物溶液及2NH2SO4。测量时先用此孔调OD值至零。
    2.为防止样品蒸发,试验时将反应板放于铺有湿布的密闭盒内。
    洗板方法
    手工洗板方法:吸去(不可触及板壁)或甩掉酶标板内的液体;在实验台上铺垫几层
    吸水纸,酶标板朝下用力拍几次;将推荐的洗涤缓冲液至少0.4ml注入孔内,浸泡1-2分钟,根据需要,重复此过程数次。
        自动洗板:如果有自动洗板机,应在熟练使用后再用到正式实验过程中。
    特异性
        本试剂盒可同时检测人ACTN-3,且与其它相关蛋白无交叉反应。
    计算
      以标准物的浓度为横坐标(对数坐标),OD值为纵坐标(普通坐标),在半对数坐标纸上绘出标准曲线,根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度;再乘以稀释倍数;或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式,将样品的OD值代入方程式,计算出样品浓度,再乘以稀释倍数,即为样品的实际浓度。
    注意事项
    1. 洗涤过程非常重要,不充分的洗涤易造成假阳性。
    2. 一次加样时间最好控制在5分钟内,如标本数量多,推荐使用排枪加样。
    3. 请每次测定的同时做标准曲线,最好做复孔。
    4. 如标本中待测物质含量过高,请先稀释后再测定,计算时请最后乘以稀释倍数。
    5.在配制标准品、检测溶液工作液时,请以相应的稀释液配制,不能混淆。
    6.底物请避光保存。

    说明
    1. 在储存及孵育过程中避免将试剂暴露在强光中。所有试剂瓶盖须盖紧以防止蒸发和污染,试剂避免受到微生物的污染,因为蛋白水解酶的干扰将导致出现错误的结果。
    2. 小心吸取试剂并严格遵守给定的孵育时间和温度。请注意在吸取标本 / 标准品,酶结合物或底物时,第一个孔与最后一个孔加样之间的时间间隔如果太大,将会导致不同的 “预孵育”时间,从而明显地影响到测量值的准确性及重复性。而且,洗涤不充分将影响试验结果。
    3. 试剂盒保存:部分试剂保存于-20℃,部分试剂保存于2-8℃,具体以标签上的标示为准。
    4. 浓洗涤液会有盐析出,稀释时可在水浴中加温助溶。
    5. 刚开启的酶联板孔中可能会含有少许水样物质,此为正常现象,不会对实验结果造成任何影响。
    6. 中、英文说明书可能会有不一致之处,请以英文说明书为准。
    7. 所有的样品都应管理好,按照规定的程序处理样品和检测装置。
    8. 有效期:6个月

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