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  • 反向酵母双杂交系统的应用研究

    中国教育装备采购网 2011/9/26 17:26:00 围观2257次 我要分享

      酵母反向双杂交系统(reverse two-hybrid system)用于研究相互作用的蛋白质的功能、结构及其作用的条件,鉴定在相互作用的一对蛋白中的任一蛋白突变对其相互作用的影响,这对于多个作用分子的蛋白显得尤为重要。反向双杂交系统最早是在1996年Vidal等建立的。该系统采取反向选择筛选的方法,将蛋白质之间的解离作用变为一种选择优势是这个系统的最大的特点。酵母反向双杂交系统的关键是引入一种对细胞生长有毒的报道基因,用于监测蛋白间的相互作用。常用的报告基因有3种即URA3,CYH2和LYS2。当野生型BD-X与AD-Y间发生相互作用时,启动了毒性报告基因的表达,它对酵母菌株有毒性或者是致死的。当二者解离时毒性报告基因不能表达,菌株具有生长优势。不同的毒性报告基因都可用来提供阴性筛选。

      例如酵母URA3基因表达产物是尿嘧啶合成所必需的,同时它又可催化5-?乳清酸(5-FOA)转化为有毒物质。Vidal等构建了一酵母细胞株,其URA3的表达由含GAL4结合位点的启动子严密控制。此细胞株在缺乏尿嘧啶的培养基中培育需要GAL4激活结构域(GAD)和GAL4 DNA结合结构域(GBD)的融合蛋白的相互作用的表达。而在含5-FOA的完全培养基中则受GAD和GBD融合蛋白相互作用的抑制。因此可通过筛选5-FOA抗性克隆从随机突变库中鉴定阻断蛋白相互作用的突变体。

      反向双杂交系统可以鉴定作用缺陷等位基因、解离肽或相关的小分子物质, 它在研究蛋白质间的作用位点、蛋白质与RNA、蛋白质与药物小分子、癌症以及蛋白质组学中发挥着越来越重要的作用,在药物筛选?有着更广阔的应用前景。

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