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  • 牛病毒性腹泻抗体(BVD Ab)酶联免疫分析(ELISA)

    中国教育装备采购网2011-10-24 17:32围观27次我要分享我要投稿

    牛病毒性腹泻抗体(BVD Ab酶联免疫分析(ELISA)

    试剂盒使用说明书

    本试剂仅供研究使用       目的:本试剂盒用于检测牛血清,血浆中病毒性腹泻抗体(BVD Ab)水平。

    实验原理:

      本试剂盒采用双抗原夹心酶联免疫法(ELISA)测定标本中牛病毒性腹泻抗体(BVD Ab)。用纯化的牛病毒性腹泻抗原包被微孔板,制成固相抗原,可与样品中病毒性腹泻抗体(BVD Ab)相结合,经洗涤除去未结合的抗原和其他成分后再与HRP标记的病毒性腹泻抗原结合,形成抗原-抗体-酶标抗原复合物,经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值),与CUTOFF值相比较,从而判定标本中牛病毒性腹泻抗体(BVD Ab)的存在与否。

     

    试剂盒组成

    试剂盒组成

    48孔配置

    96孔配置

    保存

    说明书

    1份

    1份

     

    封板膜

    2片(48)

    2片(96)

     

    密封袋

    1个

    1个

     

    酶标包被板

    1×48

    1×96

    2-8℃保存

    阴性对照

    0.5ml×1瓶

    0.5ml×1瓶

    2-8℃保存

    阳性对照

    0.5ml×1瓶

    0.5ml×1瓶

    2-8℃保存

    酶标试剂

    3 ml×1瓶

    6 ml×1瓶

    2-8℃保存

    样品稀释液

    3 ml×1瓶

    6 ml×1瓶

    2-8℃保存

    显色剂A液

    3 ml×1瓶

    6 ml×1瓶

    2-8℃保存

    显色剂B液

    3 ml×1瓶

    6 ml×1瓶

    2-8℃保存

    终止液

    3ml×1瓶

    6ml×1瓶

    2-8℃保存

    浓缩洗涤液

    (20ml×20倍)×1瓶

    (20ml×30倍)×1瓶

    2-8℃保存

     

    样本处理及要求

    1. 血清:室温血液自然凝固10-20分钟,离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清,保存过程中如出现沉淀,应再次离心。

    2. 血浆:应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂,混合10-20分钟后,离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清,保存过程中如有沉淀形成,应该再次离心。

    3. 尿液:用无菌管收集,离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清,保存过程中如有沉淀形成,应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。

    4. 细胞培养上清:检测分泌性的成份时,用无菌管收集。离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清。检测细胞内的成份时,用PBS(PH7.2-7.4)稀释细胞悬液,细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融,以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成,应再次离心。

    5. 组织标本:切割标本后,称取重量。加入一定量的PBS,PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持2-8℃的温度。加入一定量的PBS(PH7.4),用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清。分装后一份待检测,其余冷冻备用。

    6. 标本采集后尽早进行提取,提取按相关文献进行,提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验,可将标本放于-20℃保存,但应避免反复冻融.

    7. 不能检测含NaN3的样品,因NaN3抑制辣根过氧化物酶的(HRP)活性。

     

    操作步骤:

    1.         编号:将样品对应微孔按序编号,每板应设阴性对照2孔、阳性对照2孔、空白对照1孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂,其余各步操作相同)

    2.         加样:分别在阴、阳性对照孔中加入阴性对照、阳性对照50μl。然后在待测样品孔先加样品稀释液40μl,然后再加待测样品10μl。加样将样品加于酶标板孔底部,尽量不触及孔壁,轻轻晃动混匀,

    3.         温育:用封板膜封板后置37℃温育30分钟。  

    4.         配液:将30(48T的20倍)倍浓缩洗涤液加蒸馏水至600ml后备用

    5.         洗涤:小心揭掉封板膜,弃去液体,甩干,每孔加满洗涤液,静置30秒后弃去,如此重复5次,拍干。

    6.         加酶:每孔加入酶标试剂50μl,空白孔除外。

    7.         温育:操作同3。

    8.         洗涤:操作同5。

    9.         显色:每孔先加入显色剂A 50μl,再加入显色剂B 50μl,轻轻震荡混匀,37℃避光显色15分钟

    10.     终止:每孔加终止液50μl,终止反应(此时蓝色立转黄色)。

    11.     测定:以空白空调零,450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。 测定应在加终止液后15分钟以内进行。

     

    结果判定:

      试验有效性:阳性对照孔平均值≥1.00; 阴性对照平均值≤0.10

      临界值(CUT OFF)计算:临界值=阴性对照孔平均值+0.15

      阴性判定:样品OD值< 临界值(CUT OFF)者为牛病毒性腹泻抗体(BVD Ab)阴性

      阳性判定:样品OD值≥ 临界值(CUT OFF)者为牛病毒性腹泻抗体(BVD Ab)阳性

    注意事项

    1.操作严格按照说明书进行,本试剂不同批号组分不得混用。

    2.试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用,酶标包被板开封后如未用完,板条应装入密封袋中保存。

    3.浓洗涤液可能会有结晶析出,稀释时可在水浴中加温助溶,洗涤时不影响结果。

    4.  封板膜只限一次性使用,以避免交叉污染。

    5.底物请避光保存。

    6.试验结果判定必须以酶标仪读数为准,使用双波长检测时,参考波长为630nm

    7.所有样品,洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。终止液为2M的硫酸,使用时必须注意安全。

     

    保存条件及有效期

    1.试剂盒保存:;2-8℃。

    2.有效期:6个月

     

     

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