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  • 用于酶联免疫测定(ELISA)酶的色原底物

    中国教育装备采购网2011-10-26 16:01围观78次我要分享

    辣根过氧化物酶的色原底物
     
        HRP最常用的色原底物有邻苯二胺(OPD)、2,2’—吖嗪—(3—乙酰苯基噻唑磺酸—6)[2,2’—azino-di(3—ethylben2thiazolinesulphonicacid-6),ABTS](杂环吖嗪)、四甲基联苯胺(TMB)和4—氨基安替比林:苯酚耦联底物对等。上述色原底物受HRP作用主要有两种形式的反应:①氧化还原底物的氧化作用,如OPD、ABTS等;②一个氨基芳香剂与另一个芳香基化合物的氧化耦联,如4—氨基安替比林:苯酚等。
        (一)氧化还原色原底物
        OPD被认为是HRP最为敏感的色原底物之一,其在HRP的作用下,由过氧化氢(H202)
    氧化而聚合成2,2’—二氨基偶氮苯(DAB)。在pH5.0左右时,DAB在波长450nm处有广范围的最大吸收,当pH值降为1.0时,最大吸收波长移动至492nm,同时摩尔消光系数变大,显色加深(图4—2)。因而常用强酸如硫酸或盐酸终止反应。实际工作中,用强酸尤其是盐酸终止反应后,显色并不稳定,常随时间增长而颜色加深,这是由于反应后剩余的过氧化氢继续氧化OPD而产生非酶催化的DAB的结果。有人在强酸反应终止液中加入还原剂如亚硫酸钠,因还原剂可迅速完全地将剩余的过氧化氢还原而阻止了OPD的非酶氧化,结果显色稳定,数十小时内不变,而且无需避光。OPD的缺点是其对机体具有致突变作用。由于OPD的不稳定性,现在的商品试剂盒中,OPD均以片剂或粉剂供应,临用时再溶解于相应的缓冲液。
        在ELISA测定时,OPD色原底物的具体配方为①显色底物溶液:在0.1mol/L枸橼酸盐缓冲液(pH5.0)中含20 mmol/L OPD和12 mmo!/L H202,或10 mmol/L OPD和5.5mmol/L H202;②终止液:2 mol/L硫酸(含0.1 mol/L亚硫酸钠);③测定波长:492nm。
        TMB是一种优于OPD的新型HRP色原底物。其氧化产物联苯醌在波长450nm处有最大消光系数,如果HRP量少,过氧化氢溶液和TMB过量时,则形成蓝色的阳离子根。降低pH,即可使蓝色的阳离子根转变为黄色的联苯醌(图4—3)。使用硫酸作为终止剂可使产物稳定90min,但随后本底显色就不断加深,国内有人认为使用1%SDS作为终止剂,可使鲜蓝色24h内保持不变,阴阳性对比十分明显,但在我们实验室发现1%SDS对上述显色有较强的褪色作用,目前仍以硫酸作为终止剂较为理想。ELISA中,底物反应显色后,常选择其具最大吸收的波长450nm比色测定结果。而’Madersbacher和Berger等为提高以TMB作底物的ELISA测定的敏感性,选择显色呈指数加深时的波长405nm比色测定。他们首先测定一系列已知浓度的标准品在450nm和405nm的值,证实A450nm/A405nm之比为3.2,然后在使用波长405nm测定含低浓度待测物的标本得到的OD值再乘以常数3.2,即为待测标本在波长450nm处的真值。该种双波长测定方法可使ELISA测定范围提高3倍。TMB的显色反应虽与OPD一样同属氧化还原反应,但前者的反应是可逆的,如终止液中存在还原剂(维生素C及亚硫酸钠、SDS等),则可反应显色迅速消退。TMB虽然溶解度相对较低,但由于其高检测敏感性及无致突变作用,现已基本上取代了OPD而成为HRP最为常的色原底物。
        在商品ELISA试剂盒尤其是国内的产品中,TMB色原底物常为已配好的A及B两种液态试剂,其中一种是含一定浓度过氧化氢的溶液,一种为TMB溶液,鉴于过氧化氢、TMB在溶液中相对不稳定的特点,因此,我们在使用ELISA试剂盒时,如发现底物A和(或)B出现颜色,或二者各取一滴混合后显色,说明该试剂盒的底物溶液已变质或已受污染,必须废弃。
        在ELISA测定时,TMB色原底物的具体配方为①显色底物溶液:先将TMB以0.1 mol/L的浓度溶于二甲亚砜,然后,再将其以1 mmol/L和H202以3.0 mmol/L的浓度溶于0.2mol/L醋酸钠/枸橼酸缓冲液(pH4.0),即可应用。②终止液:2 mol/L硫酸。③测定波长:450nm。
        ABTS也是HRP的一种高灵敏底物。在H:O:存在下,ABTS的氨盐转变为易发生歧化的阳离子根(图4—4)。阳离子根为绿色,与OPD的黄色氧化产物相比更适于可见光测定(测定波长入=414nm)。上述显色也不稳定,10 mmol/L叠氮钠是较为理想的终止剂,可使显色稳定数十小时,且可减少阳离子根的歧化。另有人报道用1.25%NaF终止反应效果较好。
        ABTS在目前国内的ELISA试剂盒中基本上没有应用,但在国外ELISA试剂盒偶见有应用。
        在ELISA测定时,ABTS色原底物的具体配方为①显色底物溶液:先将ABTS以2 mmol/L和H202以2.5 mmo!/L的浓度溶于0.1 mol/L醋酸盐缓冲液(pH 4.2),即可应用;②终止液:10 mmol/L叠氮钠;③测定波长;414nm或405nm。
        除上述三种外,HRP的氧化还原底物尚有O-dianisidine(ODA),5—氨基水杨酸(5—AS)以及dicarboxindine等。
        (二)氧化耦联色原底物对
    HRP的氧化耦联色原底物对主要有4—氨基安替比林:苯酚耦联底物对(Trinder试剂)和2—甲基—2—苯并噻唑啉腙(MBTH);二甲基苯胺(DMA)耦联底物对(Ngo—Lenhoff试剂)等。
        在H202存在下,4—氨基安替比林和苯酚经HRP作用缩合形成红色的醌亚胺,其在入=492 nm处有最大吸收(图4—5)。
        该耦联色原底物对用于固相ELISA时,敏感性一般较低,反应见光不稳定,而且苯酚易发生多聚化,缺乏适当的反应终止剂。因此,该试剂常限于葡萄糖、三酰甘油、肌酸激酶等临床生化指标的酶法检测应用。1989年日本学者用其作为色原底物建立了一种以HRP作标记酶的均相酶免疫试验,可用甲醛终止反应。但这种方法仅停留在实验室阶段,其后也未见有其他实验室的应用报道,可能还有其固有的缺陷。
        4—氨基安替比林:苯酚耦联底物对色原底物的具体配方为①显色底物溶液:将4—氨基安替比林以2 mmol/L,苯酚以25 mmol/L和H202以0.8 mmol/L的浓度溶于0.1 mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.2),即可应用;②终止液:未见报道;③测定波长:492nm。
        MBTH和DMA在HRP的作用下缩合生成紫蓝色的吲达胺(indamine),最大吸收波长为590nm,见光不稳定。用盐酸或硫酸终止反应后,pH应为3.0左右,pH值的降低使显色从紫蓝色转变为清晰的蓝色,最大吸收波长从590nm变为595nm,然而pH值的进一步降低,将导致光吸收消失。
        MBTH:DMA耦联对在固相ELISA测定几乎没有应用。
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