人工半自动与全自动表型分析技术比较—大麦硼/锗胁迫QTL定位研究
Mark Crowe, Bettina Berger and Mark Tester
The Plant Accelerator, University of Adelaide Waite Campus, Hartley Grove, Urrbrae SA 5064, Australia
2011年10月
设计
早在1999年，Jefferies教授利用传统、主观的人眼观察方法对硼胁迫条件下大麦的表型进行了鉴定，成功获得了四个与耐硼胁迫相关的QTLs，它们分别控制四种不同的表型。近期，Julie Hayes和她的团队在澳大利亚功能基因组学研究中心(Australia Center for Plant Functional Genomics, ACPFG)，采用相同的QTL定位群体进行了第二个独立的试验。试验中她们用锗代替硼对大麦进行胁迫处理，利用LemnaTec全自动成像系统(与植物加速器Plant Accelerator相似)对植株表型进行鉴定和分析，再一次成功验证了先前获得的QTLs与某一表型密切相关。本研究中，我们还发现利用全自动成像系统鉴定分析植物表型，具有更大的潜在优势，这其中便包含了可以大幅度降低人力投入，以及简便的对一些更加复杂的抗性QTL的发掘和鉴定等等。
背景
硼是一种植物生长所必需的微量元素，但土壤中的硼含量较高(>1-2ppm)时会对植物产生毒害，导致粮食作物产量显著下降，这在澳大利亚南部、西亚和北非部分地区较为常见。大麦中存在硼耐性的遗传变异， Sahara 3771对硼胁迫具有较强的耐受能力，而Clipper则对硼胁迫较为敏感，本研究便是利用它们的杂交群体作为QTL定位群体。植物对于硼胁迫的响应是多方面的，其中主要包括组织排除、组织耐性、根系形态改变等等，大麦中最明显的特征是叶片从顶部逐渐萎黄坏死(如图1)，但这并非与耐性必然相关。
锗的化学结构和性质与硼(还有硅)相似，但不同的是，锗并非植物生长所必需的微量元素，也不会在自然情况下过量抑制植物生长。然而，它与硅化学属性的相似性，就注定其在植物硅元素吸收研究中具有非常重要的作用。此外，在大麦中锗还可以通过一个硼转运蛋白(HvNIP2;1)进行转运。这表明在适合的浓度条件下，它能够诱发与硼胁迫相似的症状表征，并可能与之前定位的QTL连锁。本研究利用Sahara 3771(硼-耐受型变种)和Clipper(硼-敏感型变种)的杂交群体作为QTL定位群体，比较了三种不同的方法：传统的人眼评定和破坏性表型测定方法;采用LemnaTec成像和分析技术的半自动破坏性测定方法;假定采用植物加速器LemnaTec系统的全自动测定方法。
图1 硼毒性处理14天后，对硼不同敏感性的两个变种Sahara 3771和Clipper幼苗的叶片特征，锗处理与鹏处理效果完全相同。
实验设计
Jefferies的实验筛选了四个不同的表型：溶液培养相对根长、坏死的叶片损伤、组织硼浓度和干物质量。其中组织硼浓度，即使采用先进的植物加速器成像系统也必须破坏植物，因此该指标不列入比较之列，而其他三个指标能够通过图像数据分析测定或准确估计。Julie Hayes的锗毒素测定实验仅对叶片症状进行了测定。
传统表型测定
相对根长
从定位群体中选择150个株系，每个株系2次重复，在滤纸(对照：不含硼溶液;处理：100mg/l硼溶液)上发芽，之后转移至箔纸包被的卷筒纸中生长12天，选取最长根测定。相对根长(RRL)以处理根长占对照根长的百分数来表示。
叶片损伤
每个株系的2次重复都种在对照和硼处理(100mg/kg)土壤中，四周后对每个植株叶片坏死程度测定分级：1(无可见症状)-6(>90%坏死)。
生物量
获得植物叶片损伤后一周，所有植物从地平面以上1cm收获，烘干称重。
该表型测定方法的详细步骤，请参见Jefferies et al, 1999.
半自动表型测定
叶片损伤
从每个株系中选择3-4株幼苗，首先通过水培法培养5天，然后用40μM的GeO2进行处理，继续培养9天。随后将所有植株取出水平放置，利用LemnaTec Scanalyzer3D系统从上面对植物进行成像并加以分析，设置适当分析阈值记录坏死组织占整个植株叶片的百分数。在成像的同时，通过肉眼对每个植株的叶片坏死程度进行观察和分级。
植物加速器表型测定(假想)
叶片损伤、投影面积(估算生物量)
从定位群体中选择150个株系，每个株系2次重复，然后按照传统表型测定实验中的方法对所有单株进行培养和硼处理。5周后，将所有植株转移至标准温室中培养，并利用可见光成像单元对每一个单株从三个方向(顶部和两个侧面)进行成像，获得每个植株的叶面积，进而估算其生物量，同时叶片坏死程度可见光图像的颜色分析或者荧光成像的叶绿素健康程度分析获得。
相对根长
根长实验需要为每一个株系设置一个额外的、无硼处理的对照，因为这里的根长是相对根长而并非绝对值。对照和处理植株都被种植在植物加速器特定的根系观测盆(透明，高400mm，宽120mm，深40mm)中，通过可见光成像对附着于透明测量盆表面的根系进行成像，对图像进行分析获得植株根长。值得注意的是，这些植株可以取代上面所提到的进行生物量和叶片损伤测定的植株，不需要额外增加植株数量。此外，还可以在根系未长至观测盆底部的时候额外进行一次成像。
结果
传统的实验定位了与硼耐性评定相关的4个QTL：叶片症状2H染色体QTL、相对根长的3H染色体QTL、组织硼浓度的6H染色体QTL和所有4种表型(第4种为生物量)的4H染色体QTL，这与之前的研究结果(三个主效基因座位与硼耐受性连锁)是一致的。
基于图像的半自动测定实验再次发现了之前研究中的两个QTL，即叶片症状(2H)和组织硼浓度(6H)，这或多或少让人觉得有一些奇怪，尽管采用了不同的测定方法。以往的研究表明，6H QTL(硼转运蛋白HvNIP2;1)的候选基因也能转运锗，但并没有表明与叶片症状连锁的报道。而另一方面，2H QTL虽然与叶片症状紧密连锁，但也没有证据表明它在无硼胁迫条件下具有显著作用。更为有趣的是，该方法并没有发现4H QTL，该QTL的候选基因是一个硼酸盐转运蛋白，并且具有很强的特异性，并不像其它两个QTL那样具有硼/锗交互活性。与传统观察方法一样，图像分析方法同样可以获得相同的QTL位点，仅在主峰上面一个微小的次级峰存在差异(如图2)，该区域的一个基因能够控制开花时间，还可能与幼苗发育速度和叶片大小形态有密切关系。传统观察方法分析获得的该次级峰稍大，这表明该方法受成熟度差异影响较大，而该差异并非由于锗胁迫造成的。
当然，对于假想的全自动植物加速器实验，我们没有任何数据，但是种种情况表明运用这种方法，我们很可能会鉴定出以上的3个QTLs，甚至是6H QTL(第二个试验中与叶片症状密切相关，但测定的前提是破坏植物叶片)。此外，通过这种全自动的方法，我们就能够客观、准确的定位更多的QTL，即使是一些微小表型变化的基因。
图2 与锗胁迫引起叶片症状连锁的2H QTL，分别采用LemnaTec图像分析方法(左)和传统的观察方法(右)。圆圈区域突出显示了一个次级QTL，与图像分析法相比，运用传统方法获得的数据更加显著。
植物加速器的优势
如上所述，即使在某一个时间点进行比较，植物加速器也能够显示出明显的优势。Jefferies所采用的测量根长和叶片损伤的方法会耗费大量的时间，并受人主观性的影响，就连Julie Hayes也表示采用半自动成像方法也需要花费两天的时间对植株进行成像，如果能够采用新型的全自动成像技术，毕竟会节约大量的人力和时间，并大大增加实验数据的客观性。这些都表明利用植物加速器全自动成像技术，具有其他方法所无法比拟的优势，获得的大量数据信息对于更深入的发现和鉴定硼胁迫响应QTL具有重要意义!除此之外，利用植物加速器全自动成像技术，还可以观察记录一定时期内植物对硼/锗胁迫的响应情况，能够做到每隔一天便进行一次根长、组织损伤和叶面积的测定，同时获得更多更可靠的表型数据信息，从而发现植物表型的特异变化，发掘并定位更多与硼/锗胁迫相关的QTL。
其它注意的几点
(1) 对于一些简单的遗传性状(如硼胁迫耐性，只有4个主效基因座位)，植物加速器全自动成像技术依然比传统的观察方法更具优势，但可能没有研究一些复杂性状(性状表达呈连续分布)更加明显;
(2) 比较三种方法所需要的成本，仅叶片症状分析就需要$1000左右(不包括定位群体的构建和表型表达后的统计学分析，但包括了人力、耗材以及温室费用)。然而，利用植物加速器全自动成像系统估算生物量则没有任何附加费用，这几乎节约了一半的成本，而根系长度测定($1000月)与手工测定费用基本持平。
(3)
致谢
感谢Julie Hayes对本文实验设计和数字图像的详细说明，对表型数据处理和结果分析的深入注解，同时感谢Tim Sutton对本文提出的宝贵意见和建议。
参考文献
1) Jefferies SP, Barr AR, Karakousis A, Kretschmer JM, Manning S, Chalmers KJ, Nelson JC, Islam A, Langridge P. 1999. Mapping of chromosome regions conferring boron toxicity tolerance in barley (Hordeum vulgare L.). Theoretical and Applied Genetics 98: 1293–1303.
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