猪免疫球蛋白E试剂盒操作方法

中国教育装备采购网2012-11-19 15:52围观1888次我要分享

  本试剂盒仅供研究使用。

  检测范围: 96T

  10μg/ml -320μg/ml

  使用目的:

  本试剂盒用于测定猪血清、血浆及相关液体样本中免疫球蛋白E(IgE)含量。

  实验原理

  本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中猪免疫球蛋白E(IgE)水平。用纯化的猪免疫球蛋白E(IgE)抗体包被微孔板,制成固相抗体,往包被单抗的微孔中依次加入免疫球蛋白E(IgE),再与HRP标记的免疫球蛋白E(IgE)抗体结合,形成抗体-抗原-酶标抗体复合物,经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的免疫球蛋白E(IgE)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值),通过标准曲线计算样品中猪免疫球蛋白E(IgE)浓度。

  试剂盒组成

  130倍浓缩洗涤液20ml×1瓶7终止液6ml×1瓶

  2酶标试剂6ml×1瓶8标准品(640μg/ml)0.5ml×1瓶

  3酶标包被板12孔×8条9标准品稀释液1.5ml×1瓶

  4样品稀释液6ml×1瓶10说明书1份

  5显色剂A液6ml×1瓶11封板膜2张

  6显色剂B液6ml×1/瓶12密封袋1个

  标本要求

  1.标本采集后尽早进行提取,提取按相关文献进行,提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验,可将标本放于-20℃保存,但应避免反复冻融

  2.不能检测含NaN3的样品,因NaN3抑制辣根过氧化物酶的(HRP)活性。

  操作步骤

  1. 标准品的稀释:本试剂盒提供原倍标准品一支,用户可按照下列图表在小试管中进行稀释。

  320μg/ml5号标准品150μl的原倍标准品加入150μl标准品稀释液

  160μg/ml4号标准品150μl的5号标准品加入150μl标准品稀释液

  80μg/ml3号标准品150μl的4号标准品加入150μl标准品稀释液

  40μg/ml2号标准品150μl的3号标准品加入150μl标准品稀释液

  20μg/ml1号标准品150μl的2号标准品加入150μl标准品稀释液

  2. 加样:分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂,其余各步操作相同)、标准孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样50μl,待测样品孔中先加样品稀释液40μl,然后再加待测样品10μl(样品最终稀释度为5倍)。加样将样品加于酶标板孔底部,尽量不触及孔壁,轻轻晃动混匀。

  3. 温育:用封板膜封板后置37℃温育30分钟。

  4. 配液:将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用

  5. 洗涤:小心揭掉封板膜,弃去液体,甩干,每孔加满洗涤液,静置30秒后弃去,如此重复5次,拍干。

  6. 加酶:每孔加入酶标试剂50μl,空白孔除外。

  7. 温育:操作同3。

  8. 洗涤:操作同5。

  9. 显色:每孔先加入显色剂A50μl,再加入显色剂B50μl,轻轻震荡混匀,37℃避光显色15分钟.

  10. 终止:每孔加终止液50μl,终止反应(此时蓝色立转黄色)。

  11. 测定:以空白空调零,450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。 测定应在加终止液后15分钟以内进行。

  操作程序总结:

  

 

  计算

  以标准物的浓度为横坐标,OD值为纵坐标,在坐标纸上绘出标准曲线,根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度;再乘以稀释倍数;或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式,将样品的OD值代入方程式,计算出样品浓度,再乘以稀释倍数,即为样品的实际浓度。

  注意事项

  1.试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用,酶标包被板开封后如未用完,板条应装入密封袋中保存。

  2.浓洗涤液可能会有结晶析出,稀释时可在水浴中加温助溶,洗涤时不影响结果。

  3.各步加样均应使用加样器,并经常校对其准确性,以避免试验误差。一次加样时间最好控制在5分钟内,如标本数量多,推荐使用排枪加样。

  4. 请每次测定的同时做标准曲线,最好做复孔。如标本中待测物质含量过高(样本OD值大于标准品孔第一孔的OD值),请先用样品稀释液稀释一定倍数(n倍)后再测定,计算时请最后乘以总稀释倍数(×n×5)。

  5. 封板膜只限一次性使用,以避免交叉污染。

  6.底物请避光保存。

  7.严格按照说明书的操作进行,试验结果判定必须以酶标仪读数为准.

  8.所有样品,洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。

  9.本试剂不同批号组分不得混用。

  10. 如与英文说明书有异,以英文说明书为准。

  保存条件及有效期

  1.试剂盒保存:;2-8℃。

  2.有效期:6个月

来源:上海恒远生物科技有限公司作者:上海恒远生物科技有限公司

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