最新研究——免疫沉淀的改进新方法

中国教育装备采购网2012-12-26 16:53围观1677次我要分享

  免疫沉淀的改进方法

  免疫沉淀是研究蛋白质常用的技术,是利用抗体特异性反应纯化富集目的蛋白的一种方法。抗体与细胞裂解液或表达上清中相应的蛋白结合后,再与蛋白A/G(ProteinA/G)或二抗偶联的agaose或Sepharose珠子孵育,通过离心得到珠子-蛋白A/G或二抗-抗体-目的蛋白复合物,沉淀经过洗涤后,重悬于电泳上样缓冲液,煮沸5-10min,在高温及还原剂的作用下,抗原与抗体解离,离心收集上清,上清中包括抗体、目的蛋白和少量的杂蛋白。

  如果蛋白样品在孵育抗体前未经珠子预处理,会导致一些非特异蛋白与ProteinA/G结合,从而干扰试验结果。另外如果同时加入抗体和珠子,有时会出现沉淀效率不高的情况。

  方法改进:

  1、预处理:在加入抗体和珠子之前,加入20-30微升50%浓度的珠子悬浮液于蛋白裂解液中,4度摇床孵育一个小时。对于经常做IP或者CO-IP的实验室,可以将同一种样品第一次预处理所用的珠子收集起来置于四度保存,以备下次沉淀同样蛋白裂解液时预处理用。

  2、抗体,珠子分别孵育。先将适量抗体加入蛋白裂解液中,4度摇床孵育过夜。然后加入适量珠子,4度摇床孵育2到3个小时。

来源:上海浩然生物技术有限公司作者:上海浩然生物技术有限公司

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