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  • 液相色谱法测定青蒿不同部位山柰素含量

    中国教育装备采购网2013-02-22 11:17围观1792次我要分享我要投稿

      摘要:青蒿可清热解暑,除蒸,截疟。用于暑邪发热,阴虚发热,夜热早凉,骨蒸劳热,疟疾寒热,湿热黄疸。是一种廉价的抗疟疾药。

      目的建立高效液相色谱法测定青蒿中山柰素的含量,并对青蒿不同部位的山柰素含量进行比较。方法岛津VPODS色谱柱(150mm×4.6mm,5μm),乙腈-0.2%磷酸溶液(35∶65)为流动相,测定波长367nm,柱温30℃,流速0.8ml/min,进样量20μl。结果山柰素在0.0218~0.436μg范围内呈现良好的线性关系(r=0.9999),平均回收率为98.70%,RSD为1.20%。结论该方法简便可行,重复性好,专属性强,可用于青蒿中山柰素的含量测定。测定结果表明,青蒿叶中山柰素的含量最高,花次之,根较少,茎最低。

      青蒿为传统清热解暑要药,来源于菊科蒿属植物黄花蒿ArtemisiaannuaL.的干燥地上部分[1],性味苦寒,归肝、胆、肾经,具清热、祛暑、除蒸、截疟等功效,临床上主要用于治疗阴虚发热、暑热外感、疟疾、湿热黄疸诸证。青蒿药用历史悠久,全国各地均有分布。古代本草记载中除有青蒿地上部分供药用外,还有青蒿根的药用记录[2];民间验方中亦有使用青蒿根治疗多种疾病的情况。因此,青蒿这味因青蒿素而备受人们关注的药迫切需要我们的深入研究,拓展其药用价值。

      青蒿的化学成分种类较多,主要含有挥发油、倍半萜内酯类、黄酮类、香豆素类等。目前,青蒿中的挥发油、青蒿素和香豆素类成分如东莨菪内酯等[3]均有其成分分析和含量测定的报道,但是,黄酮类成分的相关报道却未曾见过。山柰素为青蒿中黄酮类化合物之一,具有抗癌[4]、抗炎等药理活性,能反映青蒿的部分功效,因此,可作为一个指标成分进行分析。本文首次建立了青蒿中山柰素的高效液相色谱(HPLC)含量测定方法,并对青蒿不同部位(叶、花、根、茎)的山柰素含量进行分析和比较,为青蒿药材和制剂的质量控制提供参考。

      1仪器与试药

      岛津(SPD-10A,LC-10AT)高效液相色谱仪;UV1100紫外-可见分光光度计。山柰素对照品(中国药品生物制品检定所,供含量测定用);乙腈、甲醇为色谱纯,水为纯净水,其余试剂均为分析纯。

      青蒿药材采自四川省安岳县青蒿基地,经笔者鉴定为菊科植物黄花蒿ArtemisiaannuaL.的干燥全株。

      2方法与结果

      2.1色谱条件色谱柱:岛津VP-ODS(150mm×4.6mm,5μm);流动相为乙腈-0.2%磷酸溶液(35:65);测定波长367nm;流速0.8ml/min;柱温30℃;进样量:20μl。在该条件下,山柰素色谱峰与相邻色谱峰达到基线分离,分离度大于1.5,理论塔板数(N)按山柰素峰计算为4000以上。对照品和样品色谱图见图1。

      2.2线性范围的考察精密称取山柰素对照品适量,加甲醇制成每毫升含山柰素0.02mg的溶液,即得。将上述对照品溶液制成一系列不同浓度的对照品溶液,分别进样20μl,按上述色谱条件测定其峰面积。以山柰素进样量(X)为横坐标、峰面积(Y)为纵坐标,求得标准曲线的回归方程为:Y=5000000X-98335,R=0.9999。结果表明,山柰素在0.0218~0.436μg范围内呈良好线性关系。

      2.3供试品溶液的制备取青蒿药材粉末1.0g,精密称定,置锥形瓶中,精密加入甲醇50ml,称定重量,置水浴锅中加热回流60min,放冷至室温,再称定重量,用甲醇补足减失的重量,过滤,取续滤液25ml,加5ml25%盐酸,水浴回流30min,迅速冷却至室温,移置50ml容量瓶,加甲醇至刻度,摇匀,用微孔滤膜(0.45μm)滤过,取续滤液,即得。

      2.4精密度实验精密吸取对照品溶液20μl,连续进样6次,依法测定,记录峰面积,RSD为0.80%。

      2.5重复性实验取同批药材6份,精密称定,按“2.3”项下供试品溶液制备方法制备,依法测定,记录峰面积,计算山柰素的含量,平均含量为0.6751mg/g,RSD为1.14%。

      2.6稳定性实验

      2.6.1对照品溶液的稳定性实验精密量取山柰素对照品溶液,分别于0,5,10,15,20,25h进样20μl,测得山柰素峰面积值,RSD为0.92%。表明对照品溶液在25h内稳定。

      2.6.2供试品溶液的稳定性实验取青蒿全株粉末1.0g,精密称定,按“2.3”项下供试品溶液制备方法制备,分别于0,5,10,15,20,25h进样20μl,测得样品中山柰素峰面积值,RSD为1.13%。表明供试品溶液在25h内稳定。

      2.7加样回收率实验取已知含量的青蒿全株样品粉末9份,每份约0.5g,精密称定,分别加入山柰素对照品(21.8μg/ml)10,15,20ml,按“2.3”项下供试品溶液制备方法制备,并依法测定。计算回收率,结果山柰素的平均回收率为98.70%,RSD为1.20%。3种水平9次实验的加样回收率测得结果均在95%~105%之间,说明山柰素的提取和检测方法可行。

      2.8样品测定分别吸取对照品溶液和青蒿不同部位(叶、花、根、茎)的供试品溶液各20μl,注入高效液相色谱仪,按上述色谱条件测定,并计算山柰素的含量。

      3讨论

      通过紫外分光光度计对山柰素对照品的甲醇溶液,在200~400nm波长范围内进行扫描。结果发现,山柰素在215,268及367nm处均有吸收峰,由于215nm接近溶剂末端吸收,干扰较大,268nm波长下干扰峰较多,分离度较差,而在367nm处灵敏度高,杂质干扰小,最后选择367nm为含量测定的检测波长。

      实验中参考相关文献[5~8],考察了供试品溶液制备方法,比较了不同提取方法、不同提取溶剂、不同提取时间、不同溶剂体积,最后确定以甲醇回流提取效果较好。青蒿中的黄酮类化合物以苷元及苷的形式存在,因此,本实验采用酸水解后,再测定苷元的含量。

      色谱条件考察时,比较了不同比例的甲醇-0.2%磷酸溶液,结果样品峰分离度均较差。经过多次试验摸索,最终确定以乙腈-0.2%磷酸溶液(35∶65)作为含量测定的流动相,在该条件下得到的色谱峰峰形尖锐,分离度高。

      本文首次建立了青蒿中山柰素的HPLC含量测定方法,并且进行了方法学考察,结果显示该方法准确度高、专属性强、灵敏度及稳定性均较好,测定方法可靠,测定结果能客观反映青蒿药材中山柰素的含量。由该方法下测定的结果可见,青蒿叶中山柰素含量最高,花次之,根较少,茎最低。

      山柰素为青蒿中黄酮类成分之一,对其含量测定方法的研究,丰富了青蒿除青蒿素外其它有效成分研究的内容,为青蒿药材的开发利用提供了科学依据。本文仅对青蒿中的一种黄酮类成分进行了研究,今后还应进一步对其化学成分、药理作用等进行全面的研究,为青蒿的系统开发奠定基础。

    来源:仪器信息网我要投稿
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