植物病毒双链RNA(dsRNA)的提取

中国教育装备采购网2013-04-19 14:08围观2022次我要分享

  一、概念

  RNA病毒复制过程会产生长度与基因组相似的dsRNA,某些dsRNA病毒的子代基因组也是

  dsRNA,并且这些dsRNA相对于ssRNA稳定的多,因此,通过简单dsRNA分析技术可对RNA病毒进行鉴定和分析。dsRNA提取技术是利用CF-11纤维素能在一定的酒精浓度下特异吸附dsRNA的原理而发展起来的。纯化的dsRNA变性后可作为模板,用于合成cDNA或进行RT-PCR扩增。在dsRNA两端分别加上人工合成的DNA接头,在连接酶作用下实现dsRNA和DNA的连接,将之克隆测序,可以得到未知病毒的序列。

  二、材料和用具

  纤维素(CF-11);一次性塑料注射器作为;研钵;50m1离心管;

  液氮; 巯基乙醇;饱和酚;三氯甲烷;SDS;无水乙醇;异丙醇;琼脂糖;Tris碱;EDTA;NaCl。

  三、试验步骤

  1、取新鲜去脉的叶组织15g,在液氮中研磨成粉。

  2、加入10m1 2*STE(PH8.0),300ul巯基乙醇,6m1饱和酚,4m1三氯甲烷,1.4ml 10% SDS,充分匀浆20min。

  3、4℃下15000g离心15min,收集上清。

  4、上清液用无水乙醇调至含乙醇17%的RNA混合液,室温下混匀。

  5、称取3g纤维素(CF-11),用含17%的乙醇的1*STE平衡后装柱,用51ml的一次性塑料注射器作为 层析柱。

  6、RNA混合液上样,用90ml含17%的乙醇的1*STE洗柱。

  7、用不含乙醇的1*STE洗脱,弃取最初的5ml,收集随后的10-15ml,加等体积的异丙醇,混匀室温放置5min。

  8、4℃下15000g离心15min,弃上清。

  9、用200ul 70%的乙醇沉淀,真空干燥3min。 1

  10、沉淀及时溶解在60ul的TE中,-20℃保存。

  11、取5ul溶液杂1%琼脂糖凝胶电泳分析,比较dsRNA的相对大小,必要时回收所需要的条带 。

  12、根据凝胶电泳所显示的dsRNA的大小,与已知的RNA病毒dsRNA或相对DNA分子量Marker进行比较,确定待测病毒基因组RNA种类的大小。

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植物病毒双链RNA(dsRNA)的提取
来源:卡迈舒(上海)生物科技有限公司.作者:卡迈舒(上海)生物科技有限公司

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