用ELISA法检测幽门螺杆菌抗体

中国教育装备采购网2013-05-14 08:34围观1408次我要分享

  1983年Warren和Marshall从人胃粘膜成功地分离出幽门螺杆菌(Hp)之后,Hp与胃炎、消化性溃疡的相关性引起人们极大的兴趣。人们推测其可能成为这类疾病的致病因素之一。许多研究者正进一步探索其致病机理,并从不同角度寻找快速、可靠的检测方法。迄今为止,检测Hp的方法包括组织标本培养,切片染色,细菌直接涂片染色,快速尿素酶测定及13C尿素呼吸试验和14C尿素呼吸试验等。除尿素呼吸试验外其余方法均需通过胃镜检查才能完成,鉴于取材困难,进一步寻找检测Hp感染的免疫学方不进非常必要的。国外有人用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测临床病人血清中有Hp抗体报道,国内尚未有这方面研究报告。本文报道建立一种检测人体抗Hp抗体的ELISA的实验结果及与细菌培养法和尿素酶测定法对比检测结果,研究证明本法特异、敏感、适用于大量标本普查和及时判断治疗反应,现将结果报告如下。

  1 材料和方法

  1.1 材料

  ①40孔聚苯乙烯微量凹孔板:上海塑料三厂产品。②酶联板离心篮:根据40孔酶联板本实验室自行设计制成。③DG—Ⅰ型酶联免疫检测仪:南京华东电子管厂产品。④试剂:过氧化物酶(HRP),R2=3.2,美国Sigma公司产品。邻苯二胺(OPD):上海白鹤化工厂产品,按文献配制。包被液:取碳酸钠1.59g加碳酸氢钠2.93g,蒸馏水1000ml配成。洗涤液:以上未加吐温—20的洗涤液100ml+2%小牛血清+4%聚乙二醇(PEG)。封板液:5%小牛血清。戊二醛固定液:25%戊二醛液,100ml装,Kochligh进口分装,用时稀释成0.25%戊二醛固定液。终止液:2NH2SO4。⑤抗原的制备:将澳大利亚皇家佩思医院的Hp标准菌株(NCTC11638)及从胃镜检查患者胃粘膜活检标本分离出的Hp菌株分别接种于心脑血平板,37℃培养5d后取菌落作生化与血清学鉴定(自制兔抗Hp抗体),然后取单个菌落移种于另一血平板,继续培养3d,经鉴定后将其大量增殖培养,3d后将菌苔刮下,置生理盐水中制成菌液,加福尔马林固定(0.1%~0.3%),4℃过夜,3000r/nin离心30min,沉淀3次,将最后1次沉淀悬于少量PBS液内,用比浊管没出细菌浓度,制成含菌3×109ml,置冰箱冰冻,反复冻融3次,经显微镜检查无菌体存在后,制成可溶性抗原,采用Lowry氏法蛋白定量,-20℃保存备用。⑥临床血清标本:采自胃镜检查患者,随机采取1988年8~10月胃镜检查病人共38人,抽静脉血2ml,分离血清贮存-20℃备用。⑦阴性对照血清,进行ELISA测定,取其平均OD值作对照。⑧酶标羊抗人IgG结合物(SAHIgG—HRP)的制备:按过碘酸盐改良法,略加改进标记制成酶标抗体。即HRP8.0ml,22℃较搅20min。加乙二醇6滴,继续搅拌5min,对pH4.2,0.001mol/L醋酸盐缓冲液(用2molHC1调pH)透析过夜,中间换水4次,加羊抗人IgG(上海生物制品研究所产品)14mg,逐滴加pH,1.0mol碳酸盐缓冲液,使pH升到9.0~9.5,室温较搅2h,加硼氢化钠(4mg/ml)0.2ml,置4℃2h,对pH7.2,0.01molPB-0.4molNaCl缓冲液在4℃透析平衡。换水4次,收取透析袋内结合物,以50%饱和度硫酸铵溶液盐析去除游离酶后,测定精制结合物,E/P克分子比值合格后,将结合物小瓶分装置-20℃保存,备用。⑨尿素酶测定法和Hp的分离培养法参考文献进行。

  1.2 方法

  并稍加改进,即:抗原包被微量滴定板:用包被液将抗原按2×108亿/ml(含蛋白8.6μg)稀释后,每孔加100μ,离心篮离心20min2000r/min后,倒去孔内液体,然后加入0.25%戊二醛液50μl/孔,4℃固定30min,倒去戊二醛,用洗涤液洗3次(每次3min),加5%小牛血清液,200ml/孔,经37℃30min封板后倒去孔内液体。每孔加待检血清(1:100稀释)100ml,37℃保温1h后,如上洗涤3次,同时做阴性对照孔和空白孔。之后于各孔内加和新鲜稀释的酶标羊抗人IgG结合物100ml,37℃保温半小时,于各孔中加入2NH2SO450μl终止反应后,于酶联测定仪以波长490nm测定OD值,将测得标本OD值(P)与阴性对照OD值(N)比(P/N),若P/N比大于或等于2.0为阳性。

用ELISA法检测幽门螺杆菌抗体
来源:卡迈舒(上海)生物科技有限公司.作者:卡迈舒(上海)生物科技有限公司

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