一站式植物mRNA提取试剂盒

中国教育装备采购网2013-06-25 13:39围观1359次我要分享

  产品及特点 构建cDNA文库、蛋白质的体外翻译和RT-PCR方法检测稀有的mRNA等研究常常需要从总RNA中分离mRNA,mRNA只占总RNA的1%左右,但由于带Poly(A)尾巴,所以可以通过与Oligo(dT)纤维素的亲和结合而与其他RNA(如rRNA、tRNA等)分离开。本产品专门用于从植物组织中一站式提取mRNA,它具有下列特点:

  1. 一站式,是有天泽基因的高效、无多糖柱式植物RNA提取试剂和mRNA提取试剂两个产品整合而成,即开即用,非常方便。

  2. 一次可以处理50-500 mg的植物组织,能得到约10-15ug总RNA,从中可得0.1-0.5ug左右的mRNA。

  3. Oligo(dT)纤维素吸附能力强,每克可以吸附50-80 OD的mRNA,相当于2000-3000ugmRNA。

  4. mRNA的操作过程简单,只需要离心就可以完成,免去了常规的灌柱、洗柱等繁琐操作。

  5. 得到的mRNA可以直接用于构建cDNA文库、蛋白质的体外翻译和RT-PCR。

  规格及成分 成 份 25次包装

  柱式植物RNAout溶液A 50 mL

  柱式植物RNAout溶液B 15 mL

  柱式植物RNAout溶液C 50 mL

  离心吸附柱 50套

  通用洗柱液 50 mL

  RNA洗脱液 10 mL

  结合液 100mL

  Oligo(dT)纤维素 25mg

  RNase-free水 10mL

  微量核酸沉淀剂 10mL

  使用手册 1份

  运输及保存 常温运输,4℃保存,Oligo(dT)纤维素低温运输,-20℃保存,有效期一年。

  自备试剂 氯仿,RNase-free收集管。

  使用方法 第一步,用植物RNAout的方法提取植物总RNA,最后用50uL洗脱,将两管收集在一起,共得到100uL总RNA(详细操作见下):

  1. 估算植物组织细胞的用量。每次微量提取一般需要100-200 mg植物叶片、或50-100 mg植物种子、或200-500 mg植物果实。

  2. 先将新鲜植物组织剪切成小块(保存在RNALOCKER中的植物组织需用纸吸去RNALOCKER液体后再剪切成小块),放入10-15 mL塑料离心管中,加入1 mL溶液A,然后用匀浆器匀浆5-20秒。匀浆时会产生泡沫,但不影响提取效果。也可以使用液氮砚磨法破碎植物组织,砚磨完后加入1 mL溶液A。注意:溶解溶液A沉淀。溶液A在4℃放置后可能会产生沉淀,使用前必须放在65℃水浴使沉淀彻底溶解并充分摇匀后再取用。

  3. 将匀浆物或砚磨物转移至干净的1.5 mL塑料离心管中(可以不必转移非液体的细胞碎片)。有的植物组织(比如果实)含有大量水份,匀浆液会多于1 mL,转移时也只取1 mL。

  4. 在离心管中加入0.3 mL的溶液B和0.2 mL自备氯仿,在振荡器上振荡30秒混匀,此时溶液呈均匀的乳浊状。振荡器振荡时必须使管底溶液震荡起来。

  5. 室温12000 rpm离心3-5分钟,两相间将有约5-10毫米厚的细胞破碎物。

  6. 将上清液(约0.6 mL)转移到另一干净的1.5 mL塑料离心管中,下层有机相和中间层含有DNA、蛋白质和其他杂质,避免触及或吸取。最好留下100 uL上清液不取。

  7. 加入等体积的溶液C,充分颠倒混匀。

  8. 将一半的溶液转移到离心吸附柱(60911B)中,12000 rpm室温离心半分钟,弃穿透液。

  9. 将剩下的一半溶液转移到同一离心吸附柱中, 12000 rpm室温离心半分钟,弃穿透液。

  10. 加0.7 mL通用洗柱液,室温离心半分钟,弃穿透液。

  11. 加0.3 mL通用洗柱液,室温离心半分钟,弃穿透液。此步可以省略。

  12. 室温离心半分钟。此步十分重要,否则残留的乙醇会影响RNA的使用。

  13. 将离心吸附柱转移到RNase-free收集管中,加入50-100 uL RNA洗脱液,室温放置1-2分钟。

  14. 12000 rpm室温离心半分钟,离心管中溶液即为RNA样品,可以立即使用或存放于-80℃待用。

  第二步,从总RNA中纯化mRNA(详细操作见下):

  本产品提供本产品提供25 mg Oligo(dT)纤维素,每克Oligo(dT)纤维素能够结合50-80 OD的mRNA。

  1. 在一个1.5 mL塑料离心管中称取1 mg Oligo (dT)纤维素。将0.5 mL结合液加入到一管装有1 mg Oligo (dT)纤维素的离心管中,混匀后室温放置5分钟。也可以将250 uL 结合液加入到装有25 mg Oligo(dT)纤维素的离心管中,每次取10 uL、相当于1 mg Oligo (dT)纤维素、与0.5 mL结合液混匀,室温放置5分钟。剩余部分放-80℃保存。

  2. 200-1000 g离心30秒,小心吸弃上清后留Oligo (dT)纤维素沉淀待用。

  3. 将第一步制备的总RNA 100 uL(如果体积不足100 uL,用水补足),65℃加热5分钟。

  4. 加入等体积的结合液,混匀后冷却到室温后,全部转移到装有Oligo(dT)纤维素的离心管中。

  5. 混匀后室温放置5分钟,期间颠倒混匀数次。

  6. 4℃ 200-1000 g离心5分钟,小心将上清转移到一个离心管中。此上清液是去除了mRNA的总RNA。可以冰箱保存作为阴性对照。

  7. 加入0.5 mL结合液,混匀后4℃ 200-1000 g离心5分钟,小心弃上清。

  8. 重复上步2-4次。

  9. 加入50 uL RNA洗脱液,混匀后4℃ 200-1000 g离心5分钟,小心收集上清(mRNA)。

  10. 重复上步1-3次。

  11. 将各次收集的mRNA混合,即为mRNA溶液。此溶液可以直接使用。如果太稀,可以按第三步方法浓缩。

  第三步,用微量核酸沉淀剂沉淀mRNA(详细操作见下):

  1. 按2:1的比例将本产品与第三步得到的mRNA溶液混合。注意:微量核酸沉淀剂有不溶的核酸助沉剂,所以用前需要摇匀以便所取的部分含有一定量的核酸助沉剂。

  2. 室温15000 g离心10分钟(如果核酸含量在2 ng以下,建议离心30分钟)。

  3. 弃上清后加75%乙醇1 mL,振荡混匀。

  4. 15000 离心3-5分钟,弃上清。

  5. 再短暂离心后小心吸弃上清,沉淀即为回收的mRNA沉淀,可溶于DEPC水中直接使用或放-70℃长期保存。

来源:上海研生实业有限公司作者:上海研生实业有限公司

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