一站式血液mRNA提取试剂盒

中国教育装备采购网2013-06-25 13:40围观1370次我要分享

  产品及特点 构建cDNA文库、蛋白质的体外翻译和RT-PCR方法检测稀有的mRNA等研究常常需要从总RNA中分离mRNA,mRNA只占总RNA的1%左右,但由于带poly(A)尾巴,所以可以通过与Oligo(dT)纤维素的亲和结合而与其他RNA(如rRNA、tRNA等)分离开。本产品专门用于从全血中一站式提取mRNA,它具有下列特点:

  1. 一站式,是由天泽基因的高效、全血RNA提取试剂和mRNA提取试剂两个产品整合而成,即开即用,非常方便。

  2. 一次可以处理0.5-1.5 mL的全血,能得到约2-3 ug总RNA,其中1-5%为mRNA。

  3. 提供的Oligo(dT)纤维素吸附能力强,每克可以吸附50-80 OD的mRNA,相当于2000-3000 ug mRNA。

  4. mRNA提取过程操作简单,只需要离心就可以完成,免去了常规的灌柱、洗柱等繁琐操作,样品也不会被稀释。

  1. 得到的mRNA可以直接用于构建cDNA文库、蛋白质的体外翻译和RT-PCR。

  规格及成分 成 份 25次包装

  柱式血液RNAout, 50次

  (CAT#:71202-50) 溶液A 50 mL

  溶液B 15 mL

  溶液C 50 mL

  离心吸附柱 50套

  通用洗柱液 50 mL

  RNA洗脱液 5 mL

  使用手册 1份

  mRNAout

  (CAT#:80817-25) 结合液 100 mL

  Oligo(dT)纤维素 25 mg

  RNA洗脱液 5 mL

  使用手册 1份

  微量核酸沉淀剂

  (CAT#:50903-10) 微量核酸沉淀剂 10 mL

  使用手册 1份

  运输及保存 常温运输,Oligo(dT)纤维素最好-20℃保存,RNA洗液4℃保存,其余产品可以室温放置。本产品有效期一年。

  自备试剂 氯仿、75%乙醇。

  使用方法 一:用柱式血液RNAout提取总RNA

  1. 将0.2-1.5 mL新鲜或解冻后的抗凝全血加入到1.5 mL塑料离心管中。

  2. 12000-15000 g室温离心3分钟,弃上清(血浆)。如果此时血液细胞沉淀体积大于0.2 mL, 则需要减少血液的使用量,具体减少量需根据具体情况决定,因为各个个体(尤其是患者)血液中白细胞数目差别很大。

  3. 将1 mL溶液A加入到血液细胞沉淀中,用移液枪吹打沉淀使细胞裂解。

  4. 将0.3 mL的溶液B加入到离心管中,剧烈震荡30秒。

  5. 和0.2 mL氯仿加入到离心管中,剧烈震荡30秒。

  6. 12000-15000 g室温离心3-5分钟,将上清液(为无色或浅红色,约0.5-0.9 mL)转移到另一干净离心管中。注意:转移的液体不要超过0.7 mL,否则下一步不能加入等体积的溶液C。为防止污染,最好留100 uL左右的上清液。下层有机相一般呈深红色,中间层为白色,含有DNA,蛋白质和其他细胞破碎物,避免触及或吸取。

  7. 加入等体积的溶液C,充分颠倒混匀。

  8. 分两次将溶液转移到离心吸附柱中,每次转移后12000-15000 g室温离心半分钟,弃穿透液。

  9. 加0.7 mL通用洗柱液,室温离心半分钟,弃穿透液。

  10. 如果有必要,可以再加0.3 mL通用洗柱液,室温离心半分钟,弃穿透液。注意:增加此步可以进一步提高RNA的纯度。

  11. 室温12000-15000 g离心半分钟。此步十分重要,否则残留的通用洗柱液会影响RNA的后续反应。

  12. 将离心吸附柱转移到一个RNase-free的收集管中,加入50-100 uL RNA洗脱液,室温放置1-2分钟。

  13. 12000-15000 g室温离心半分钟,离心管中溶液即为RNA样品,可以立即使用或存放于-80℃待用。

  14. RNA完整性的电泳检测:如果需要做Northern杂交,强烈建议用户使用甲醛变性胶进行RNA电泳,因为非变性胶不能分离所有的RNA分子(BioTechniques,28:414,2000)。

  15. RNA产量产率测定:将5-10 μL RNA溶于TE缓冲液中(pH7.5-8.2之间)检测其在OD260的光吸收。通过光吸收可以得出RNA浓度(1 OD260的RNA=40 μg/mL),进而计算出RNA的产量(浓度X体积)和产率(RNA产量/组织用量)。人血RNA产率一般为2-5 ug/mL。无污染的总RNA的OD260/OD280一般在2.0左右。

  二:从血液总RNA中提取血液mRNA

  本产品提供本产品提供25 mg Oligo(dT)纤维素,每克Oligo(dT)纤维素能够结合50-80 OD的mRNA。

  1. 在一个1.5 mL塑料离心管中称取1 mg Oligo (dT)纤维素。将0.5 mL结合液加入到一管装有1 mg Oligo (dT)纤维素的离心管中,混匀后室温放置5分钟。也可以将250 uL 结合液加入到装有25 mg Oligo(dT)纤维素的离心管中,每次取10 uL(相当于1 mg Oligo (dT)纤维素)与0.5 mL结合液混匀,室温放置5分钟。剩余部分放-80℃保存。

  2. 200-2000 g离心30秒,小心吸弃上清后留Oligo (dT)纤维素沉淀待用。

  3. 将在第一节中提取的两管相同的总RNA(每个样品用50 uL)混合在一起得到总RNA 100 uL,65℃加热 5分钟。也可以只用一管总RNA,但需要补水到100 uL,再65℃加热 5分钟。

  4. 加入等体积的结合液,混匀后冷却到室温后,全部转移到装有Oligo(dT)纤维素的离心管中,

  5. 混匀后室温放置5分钟,期间颠倒混匀数次。

  6. 4℃ 200-2000g 离心5分钟,小心将上清转移到一个离心管中。此上清液是去除了mRNA的总RNA。冰上放置待用。

  7. 加入0.5 mL结合液,混匀后4℃ 200-2000g 离心5分钟,小心弃上清。

  8. 重复上步2-4次。

  9. 加入50 uL RNA洗脱液,混匀后4℃ 200-2000g 离心5分钟,小心收集上清(mRNA)。

  10. 重复上步1-3次。

  11. 将各次收集的mRNA混合用于下步的核酸沉淀。

  三:用微量核酸沉淀剂沉淀mRNA

  1. 按2:1的比例将微量核酸沉淀剂与mRNA溶液混合。微量核酸沉淀剂用前需要摇匀。

  2. 室温15000 g离心10分钟(如果mRNA含量在2 ng以下,建议离心30分钟)。

  3. 小心弃上清后,加入1 mL自备的75%乙醇,振荡混匀。

  4. 15000 离心3-5分钟,小心弃上清。

  5. 再短暂离心后小心吸弃上清,沉淀即为回收的mRNA沉淀,可溶于RNA洗脱液中待用。

来源:上海研生实业有限公司作者:上海研生实业有限公司

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