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  • 雅安达:有关蛋白质提取方法

    中国教育装备采购网 2013/7/18 10:47:00 围观450次 我要分享

      一、植物组织蛋白质提取方法(summer)

      1、根据样品重量(1g样品加入3.5ml提取液,可根据材料不同适当加入),准备提取液放在冰上。

      2、把样品放在研钵中用液氮研磨,研磨后加入提取液中在冰上静置(3-4 小时)。

      3、用离心机离心8000rpm40min4℃或11100rpm20min4℃

      4、提取上清夜,样品制备完成。

      蛋白质提取液:300ml

      1、1Mtris-HCl(PH8) 45ml

      2、甘油(Glycerol)75ml

      3、聚乙烯吡咯烷酮(Polyvinylpolypyrrordone)6g

      这种方法针对SDS-PAGE,垂直板电泳!

      二、植物组织蛋白质提取方法 (summer)

      三氯醋酸—丙酮沉淀法

      1、在液氮中研磨叶片

      2、加入样品体积3倍的提取液在-20℃的条件下过夜,然后离心(4℃8000rpm以上1小时)弃上清。

      3、加入等体积的冰浴丙酮(含0.07%的β-巯基乙醇),摇匀后离心(4℃8000rpm以上1 小时),然后真空

      干燥沉淀,备用。

      4、上样前加入裂解液,室温放置30 分钟,使蛋白充分溶于裂解液中,然后离心(15℃8000rpm以上1小

      时或更长时间以没有沉淀为标准),可临时保存在4℃待用。

      5、用Brandford法定量蛋白,然后可分装放入-80℃备用。

      药品:

      提取液:含10%TCA 和0.07%的β-巯基乙醇的丙酮

      裂解液:2.7g 尿素0.2gCHAPS 溶于3ml 灭菌的去离子水中(终体积为5ml),使用前再加入1M 的

      DTT65ul/ml。

      这种方法针对双向电泳,杂质少,离子浓度小的特点!当然单向电泳也同样适用,只是电泳的条带会减少!

      三、

      组织:肠黏膜 (newinbio)

      目的:WESTERN BLOT检测凋亡相关蛋白的表达

      应用TRIPURE 提取蛋白质步骤:

      含蛋白质上清液中加入异丙醇:(1.5ml每1mlTRIPURE用量)

      倒转混匀,置室温10min

      离心:12000 g,10min,4度,弃上清

      加入0.3M盐酸胍/95%乙醇:(2ml每1mlTRIPURE 用量)

      振荡,置室温20min

      离心: 7500g,5 min,4 度,弃上清

      重复0.3M盐酸胍/95%乙醇步2 次

      沉淀中加入100%乙醇 2ml

      充分振荡混匀,置室温20 min

      离心: 7500g,5min,4度,弃上清吹干沉淀

      1%SDS溶解沉淀

      离心:10000g,10min,4度

      取上清-20 度保存(或可直接用于WESTERN BLOT)

      存在的问题:加入1%SDS 后沉淀不溶解,还是很大的一块,4 度离心后又多了白色沉定,SDS 结晶?测

      浓度,含量才1mg/ml左右。

      解决:提蛋白试剂盒,另外组织大小适中,要碎,立即加2X BUFFER,然后煮5-10分钟,效果很好的。

      四、lysis solution:(yog)

      Protein extraction buffer (Camiolo buffer):

      100 ml= (0.075M Potassium Acetate) 0.736g

      (0.3M) NaCl 1.753g

      (0.1M) L-arginine basic salt 1.742g

      (0.01M) EDTA-HCl 0.292g

      (0.25%) Triton X-100 250. ul

      五、植物材料:水稻苗,叶鞘,根(ynibcas)

      1、200 毫克样品置于冰上磨碎

      2、加lysis buffer,离心,10000rpm,4度,5min 取上清

      3、重复离心5min

      lysis buffer:urea np-40 ampholine 2-me pvp-40

      六、

      蛋白质样品制备(sigma)

      秧苗蛋白质样品的提取按Davermal 等(1986)的方法进行。

      100mg材料剪碎后加入10mgPVP-40(聚乙烯吡咯烷酮)及少量石英砂,用液氮研磨成粉,加入1.5 ml 10%

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