在不同免疫化学技术中抗体达到易接近性

中国教育装备采购网2013-08-06 10:43围观161次我要分享


  抗体的易接近性

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  依据研究抗原的特性和其制备的方法,有些表位不易与抗体接近。抗体所识别的同源表位空间封闭的最常见原因是:①其他分子的存在,特别是已经结合在抗原分子上的蛋白质或核酸可竞争性接近表位;②蛋白质抗原的修饰,特别是由细胞调节控制的蛋白质磷酸化;③如同在细胞或组织染色中发现的复合物中抗原定位问题。

  (一)多聚体相互作用

  一种类型的封闭是由结合在抗原分子上的其他分子所引起的,这种情况是由于蛋白—蛋白分子间的相互作用。如果在研究中抗体识别的表位与相互作用的蛋白结合位点重叠,就检测不到抗体—抗原间的相互结合。这可以作为一种方法来测定蛋白—蛋白分子间是否存在相互作用。这种表位竞争几乎在任何分子间相互作用中都可以发现,但最常见的是相关大分子间的相互作用,例如蛋白质或者核酸。多聚体相互作用是免疫染色、免疫沉淀和免疫亲和纯化中常见的问题,但对免疫印迹来说则不多见,因为该技术中在

  抗体加入之前抗原已经完全变性。

  

技    术
多聚体相互作用
蛋白修饰
抗原定位
频率
常用溶液
频率
常用溶液
频率
常用溶液
免疫沉淀
常见
更换抗体
可能
更换抗体,酶处理
 
N/A
免疫印迹
 
N/A
可能
更换抗体,酶处理
 
N/A
免疫亲和纯化
常见
更换抗体
可能
更换抗体,酶处理
 
N/A
免疫染色
可能遇到
更换抗体,部分蛋白溶解,微波处理
可能
更换抗体,酶处理
常见
更换抗体

  对特异的抗体—抗原来说,多聚体相互作用是影响抗体识别表位的重要因素,所以通常情况下更换一个识别不同表位的抗体即可解决。如果缺乏有关不同抗体结合位点的准确信息,简单的方法是用抗体进行检测。由于多克隆抗体通常在多个位点识别抗原,因此与抗原的结合占优势,故多抗在解决多聚体相互作用问题时成为首选。解决这个问题的第二种办法是在加入抗体之前破坏多聚体的相互作用。绝大部分蛋白—DNA、蛋白-RNA以及蛋白—蛋白分子间的相互作用,可以通过加入400mmol/L或更高浓度的盐就能破坏,同时也破坏了抗原的结构,但绝大部分抗体对抗原仍保持活性。对于多聚体更强的相互作用,可采用更剧烈的条件来破坏抗原—竞争物之间的关系。

  (二)蛋白质抗原翻译后的修饰

  阻碍抗体与同源蛋白质抗原结合的另一因素是翻译后的修饰,这种情况以蛋白磷酸化最为常见,它能封闭某些单抗与抗原结合。由于这是影响细胞或细胞群内蛋白的亚单位,通常情况下这种抗原结构的空间变化只会减少信号的强度。然而在某些情况下抗原可被完全修饰,从而阻碍了抗体与相应抗原的结合。可以更换抗体或用酶处理蛋白质抗原除去修饰来解决这一问题,例如在蛋白质抗原磷酸化的情况下可用磷酸酶处理。

  (三)定位

  抗体易接近性的第三类问题是由抗原定位引起,例如免疫染色。如果抗原被包埋在一个复合物结构中,或者由于一个障碍性的细胞结构,从物理性状上讲抗体不易与抗原结合,这是细胞或组织染色中特有的问题。

  解决这类问题比较困难,需要分别对待,因为在每一种情况下阻碍抗体达到抗原的机制是不一样的,均需要作为一个单独的问题来考虑。解决这些抗体易接近性的各种方法都涉及采用某些物理手段破坏干扰结构。最常用的两种方法是部分蛋白溶解和微波处理。部分蛋白溶解是有目的地去除抑制结构而使靶抗原不受影响,为使蛋白溶解更加有效,需要调节蛋白酶的用量及孵育时间。通过固定方法可以提供某些帮助,因为从物理上讲抗原的许多区域是通过交联结合在邻近结构上的,所以即使发生某种抗原的蛋白溶解剪接,至少部分抗原仍连接在其他局部结构上。虽然如此,只有在空间上达到易接近性才是一个有效的方法。

  达到易接近性的第二个常用办法是用微波处理样本,适当地通过细胞结构部分变性以达到目的。但需要仔细调节微波处理的时间和强度,以便使抗体达到易接近性,但又不破坏抗原或可识别的细胞形态学。

来源:上海恒远生物科技有限公司作者:上海恒远生物科技有限公司

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