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  • 有关大鼠羟基维生素D3酶联免疫的分析

    中国教育装备采购网2013-08-09 15:16围观194次我要分享

      实验原理:

      本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中大鼠25-羟基维生素D3(25(OH)D3)水平。用纯化的大鼠25(OH)D3抗体包被微孔板,制成固相抗体,往包被单抗的微孔中依次加入25(OH)D3,再与HRP标记的25(OH)D3抗体结合,形成抗体-抗原-酶标抗体复合物,经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的25-羟基维生素D3(25(OH)D3)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值),通过标准曲线计算样品中大鼠25-羟基维生素D3(25(OH)D3)浓度。

      试剂盒组成:

      试剂盒组成48孔配置96孔配置保存

      说明书1份1份

      封板膜2片(48)2片(96)

      密封袋1个1个

      酶标包被板1×481×962-8℃保存

      标准品:27μg/L0.5ml×1瓶0.5ml×1瓶2-8℃保存

      标准品稀释液1.5ml×1瓶1.5ml×1瓶2-8℃保存

      酶标试剂3 ml×1瓶6 ml×1瓶2-8℃保存

      样品稀释液3 ml×1瓶6 ml×1瓶2-8℃保存

      显色剂A液3 ml×1瓶6 ml×1瓶2-8℃保存

      显色剂B液3 ml×1瓶6 ml×1瓶2-8℃保存

      终止液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存

      浓缩洗涤液(20ml×20倍)×1瓶(20ml×30倍)×1瓶2-8℃保存

      样本处理及要求:

      1. 血清:室温血液自然凝固10-20分钟,离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清,保存过程中如出现沉淀,应再次离心。

      2. 血浆:应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂,混合10-20分钟后,离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清,保存过程中如有沉淀形成,应该再次离心。

      3. 尿液:用无菌管收集,离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清,保存过程中如有沉淀形成,应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。

      4. 细胞培养上清:检测分泌性的成份时,用无菌管收集。离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清。检测细胞内的成份时,用PBS(PH7.2-7.4)稀释细胞悬液,细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融,以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成,应再次离心。

      5. 组织标本:切割标本后,称取重量。加入一定量的PBS,PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持2-8℃的温度。加入一定量的PBS(PH7.4),用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清。分装后一份待检测,其余冷冻备用。

      6. 标本采集后尽早进行提取,提取按相关文献进行,提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验,可将标本放于-20℃保存,但应避免反复冻融.

      7. 不能检测含NaN3的样品,因NaN3抑制辣根过氧化物酶的(HRP)活性。

      操作步骤

      1. 标准品的稀释与加样:在酶标包被板上设标准品孔10孔,在第一、第二孔中分别加标准品100μl,然后在第一、第二孔中加标准品稀释液50μl,混匀;然后从第一孔、第二孔中各取100μl分别加到第三孔和第四孔,再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50μl,混匀;然后在第三孔和第四孔中先各取50μl弃掉,再各取50μl分别加到第五、第六孔中,再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul,混匀;混匀后从第五、第六孔中各取50μl分别加到第七、第八孔中,再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50μl,混匀后从第七、第八孔中分别取50μl加到第九、第十孔中,再在第九第十孔分别加标准品稀释液50μl,混匀后从第九第十孔中各取50μl弃掉。(稀释后各孔加样量都为50μl,浓度分别为18μg/L ,12μg/L,6μg/L,3μg/L, 1.5μg/L)。

      2. 加样:分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂,其余各步操作相同)、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl,然后再加待测样品10μl(样品最终稀释度为5倍)。加样将样品加于酶标板孔底部,尽量不触及孔壁,轻轻晃动混匀。

      3. 温育:用封板膜封板后置37℃温育30分钟。

      4. 配液:将30(48T的20倍)倍浓缩洗涤液用蒸馏水30(48T的20倍)倍稀释后备用。

      5. 洗涤:小心揭掉封板膜,弃去液体,甩干,每孔加满洗涤液,静置30秒后弃去,如此重复5次,拍干。

      6. 加酶:每孔加入酶标试剂50μl,空白孔除外。

      7. 温育:操作同3。

      8. 洗涤:操作同5。

      9. 显色:每孔先加入显色剂A50μl,再加入显色剂B50μl,轻轻震荡混匀,37℃避光显色15分钟.

      10. 终止:每孔加终止液50μl,终止反应(此时蓝色立转黄色)。

      11. 测定:以空白空调零,450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。 测定应在加终止液后15分钟以内进行。

      注意事项:

      1. 试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用,酶标包被板开封后如未用完,板条应装入密封袋中保存。

      2. 浓洗涤液可能会有结晶析出,稀释时可在水浴中加温助溶,洗涤时不影响结果。

      3. 各步加样均应使用加样器,并经常校对其准确性,以避免试验误差。一次加样时间最好控制在5分钟内,如标本数量多,推荐使用排枪加样。

      4. 请每次测定的同时做标准曲线,最好做复孔。如标本中待测物质含量过高(样本OD值大于标准品孔第一孔的OD值),请先用样品稀释液稀释一定倍数(n倍)后再测定,计算时请最后乘以总稀释倍数(×n×5)。

      5. 封板膜只限一次性使用,以避免交叉污染。

      6. 底物请避光保存。

      7. 严格按照说明书的操作进行,试验结果判定必须以酶标仪读数为准.

      8. 所有样品,洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。

      9. 本试剂不同批号组分不得混用。

     

    来源:北京杰辉生物技术有限公司作者:北京杰辉生物技术有限公司
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