转染方法之稳定转染VS瞬时转染

中国教育装备采购网2013-08-27 17:19围观98次我要分享

转染是将外源遗传物质导入真核细胞的过程,是细胞和分子生物学研究的重要工具。转染方法很多可谓条条大路通罗马,那么究竟是选瞬时转染好还是选稳定转染好呢?

转染是将外源遗传物质导入真核细胞的过程,是细胞和分子生物学研究的重要工具,可用于研究基因表达对细胞生理水平的影响。不论是质粒、DNA还是各种RNA(mRNA、siRNA或microRNA),要将这些外源核酸转入细胞并不容易,它们必须穿过细胞膜这层屏障才能进入细胞质。转染方法可分为物理转染和化学转染,物理转染方法包括电穿孔、显微注射和基因枪等,化学转染可使用磷酸钙共沉淀、DEAE-Dx或基于阳离子脂质的转染试剂。

上述方法都可以解决转染面临的主要挑战,即让带负电荷的核酸分子穿过带负电的细胞膜。物理转染方法一般是在细胞膜上打洞来克服静电排斥,使核酸插入。而化学转染中,一般是利用带正电的转染试剂将带负电的核酸包裹起来。这些方法都可以实现转染,可谓条条大路通罗马,那么究竟是选瞬时转染好还是选稳定转染好呢?

瞬时转染瞬时转染的细胞中,外源基因得以表达但它们并不会整合到细胞的基因组中,也就不会被复制。细胞中瞬时转染的外源基因表达时间有限,通常仅持续几天,直到外源基因在细胞分裂过程中因各种因素丢失为止。

我们如何区分细胞是否转染成功了呢?在转染质粒中往往都含有一个报告基因,来指示细胞中目标基因是否存在,这样的报告基因一般可以在转染后一两天内检测到。

稳定转染

稳定转染可以在瞬时转染的基础上建立,只不过需要一个重要的偶发过程:在少数转染细胞中,外源基因能够整合到细胞的基因组中。外源基因成为细胞基因组的一部分从而得以复制,这就是稳定转染细胞的标志。稳定转染细胞的子代细胞也同样表达外源基因,由此形成稳定转染的细胞系。

在建立上述稳定转染细胞系时,我们需要使用选择性标记来区分瞬时转染与稳定转染。将这些选择性标记与基因共表达,我们就可以筛选出外源基因已成功整合到基因组的细胞,同时剔除瞬时转染的细胞。将外源基因与抗生素抗性基因共转染(如新霉素抗性基因neo)是一种常用方法,随后可用相应抗生素(如geneticin或G418)对转染后的细胞进行筛选。只有稳定转染的细胞才会获得对抗生素的抗性,在长期培养中存活下来,由此实现对目标细胞的筛选和扩增。

孰优孰劣?

选稳定转染还是瞬时转染呢?这要看我们打算进行长期研究还是短期实验。瞬时转染一般持续几天,用瞬时转染研究基因表达,通常在转染后的24小时至96小时内收获细胞,其具体时间取决于细胞类型、载体构建等多种因素。也正因如此,瞬时转染一般用于研究基因或基因产物的短期表达,基因敲除或RNA介导的基因沉默,以及进行蛋白质小规模合成。瞬时转染mRNA比转染传统质粒DNA出结果更快,这是因为mRNA能够直接在核外表达,在一些系统中mRNA可以在转染后几分钟就得到表达。

相应的,在需要进行长期基因表达时就得进行稳定转染,例如大规模蛋白合成、长期药理学研究、基因治疗研究和长期遗传调控机制研究等等。稳定转染与瞬时转染相比,时间更长也更费劲,所以不到迫不得已一般不被选用。

以往对需要正确折叠和翻译后修饰的重组蛋白进行大规模合成,只能使用稳定转染的细胞。但近年来瞬时转染和细胞培养方法的进步改变了这一局面,经过改良之后人们已经可以通过对一些普遍使用的细胞系(如HEK293和CHO细胞)进行悬浮培养,来实现瞬时转染的大规模重组蛋白合成。

建立稳定表达的细胞系既麻烦又费劲,在合适的情况下选用瞬时表达可以省去不少精力。当然,在新的一年中转染技术的新发展无疑会进一步改进瞬时转染和稳定转染技术,使人们能够更加有效的进行外源基因表达。

来源:上海浩然生物技术有限公司作者:上海浩然生物技术有限公司

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