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  • 细胞ELISA试剂盒 冻存和细胞复苏

    中国教育装备采购网 2013/10/11 10:58:00 围观146次 我要分享

      细胞ELISA试剂盒培养技术自1907年开创以来,历经一个世纪现已成为自然科学领域不可缺少的研究方法之一。在细胞培养技术广泛用于科学研究领域的令天,细胞株的冷冻保存和解冻复苏这一基础技术日益得到重视。

      低温保存是活体组织保存最常用的方法之一。冷冻保存一般是指在0— 196 oC进行保存,就是将体外培养物悬浮在加有或不加冷冻保护剂的溶液中,以一定的冷冻速率降至零下某一温度,并在此温度下对其长期保存的过程。主要有-20~-40℃ 冰箱保存、-60~-80℃深低温冰箱和液氮(一196℃)超低温保存等。

      ELISA试剂盒应用方向

      1. 医学方面

      近年来干细胞的研究越来越被人们关注,由于它是一种具有自我复制能力的多潜能细胞,在一定条件下,可分化为多种功能细胞。

      根据发育阶段和取材来源,干细胞分为胚胎干细胞和成体干细胞两大类。骨髓和脐血是成体干细胞的主要来源。

      骨髓干细胞在骨髓中含量极少,约占骨髓有核细胞的十万分之一,所以要在临床上广泛应用首先必须具备先进的冻存与复苏技术。

      而干细胞研究的深入将解决包括癌症等一系列为人们所知的“绝症”。而“冬眠”技术对医学的发展有着里程碑式的意义。

      2. 生物学方面

      细胞冻存技术是生物学保存物种的重要手段。在环境遭到史无前例的破坏动物、植被随时可能面临灭绝危险的今天,更是尤为关键,虽然不是治本的方法,但至少可以尽可能的留下那些曾经存在的生命痕迹。

      ELISA试剂盒发展历史

      1. 1776年.Spallanzani最早发表了“冷”处理对“细胞”生命活动影响的报道。

      2. 十九世纪中后叶,许多早期的工作者(Prevost,1840;de Quatrefages,1853;Mantegazza,1866;Scheuk,1870)重复研究了低温处理对精子活动的影响,得出了和Spallanzani相似的结论。即“冷不能杀死精子”。

      3. 1900年前后,科学家基本上肯定了生物成份能够在零下温度储存的事实。

      4. 二十世纪50年代 Luyet等多位学者发现了电解质浓度对储存细胞的损伤作用,他们的基本结论是。电解质浓度增大是造成储存细胞损伤的主要原因。

      5. 1972年.Mazur等首先根据中国仓鼠组织培养细胞的低温保存实验数据分析,提出关于冷冻损伤的两因素假说目,即冰晶损伤和溶液损伤假说。

      这个假说认为随着温度的下降,细胞内外的水分结冰,所形成的冰晶会造成细胞膜和细胞器的破坏并引起细胞死亡。这种因细胞内部结冰而致的细胞损伤即就是冰晶损伤(Intracellular ice damage)。冰晶损伤是由冷却速度过快造成,冷却速度越快,冰晶损伤越大。

      同时随着温度的下降.细胞外部的水分会先结冰,从而使得未结冰的溶液中电解质浓度升高,细胞膜上的脂质会因长时问暴露在高溶质的溶液中而受到损坏,细胞发生渗漏,导致在复温时大量水分渗入细胞内造成细胞死亡。这种因保存溶液溶质浓度增高而致的细胞损伤被称为溶液损伤(Solution damage)。溶液损伤是由冷却速度过慢,使细胞在高浓度的溶液中暴露的时间过长而造成,冷却速度越慢,此损伤越严重。

      主要技术

      冻存技术

      1. 液氮法

      目前,细胞冻存最常用的技术是液氮冷冻保存法,主要采用加适量保护剂的缓慢冷冻法冻存细胞。细胞冷冻技术的关键是尽可能地减少细胞内水分,减少细胞内冰晶的形成。采用甘油或二甲基亚砜作保护剂,这两种物质分子量小,溶解度大,易穿透细胞,可以使冰点下降,提高细胞膜对水的通透性,且对细胞无明显毒性。慢速冷冻方法又可使细胞内的水分渗出细胞外,减少胞内形成冰结晶的机会,从而减少冰晶对细胞的损伤。

      常用的细胞冷冻贮存器为液氮贮存器,规格有35L3和50L3两种。

      细胞冻存时常备的材料有:0.25%胰蛋白酶,含10%~20%的血清培养液,DMSO(分析纯)或无色新鲜甘油(121°C蒸气高压消毒),2mL安瓿(或专用细胞冻存管)、吸管、离心管、喷灯、纱布袋(或冻存管架)等。

      主要操作步骤为:

      (1)选择处于对数生长期的细胞,在冻存前一天最好换液。将多个培养瓶中的细胞培养液去掉,用0.25% 胰蛋白酶消化。适时去掉胰蛋白酶,加入少量新培养液。用吸管吸取培养液反复吹打瓶壁上的细胞,使其成为均匀分散的细胞悬液。悬浮生产细胞则不要消化处理。然后将细胞收集于离心管中离心(1000r/min,10分钟)。

      (2)去上清液,加入含20%小牛血清的完全培养基,于4℃预冷15分钟后,逐滴加入已无菌的DMSO或甘油,用吸管轻轻吹打使细胞均匀,细胞浓度为3×106~1×107/mL之间。

      (3)将上述细胞分装于安瓿或专用冷冻塑料管中,安瓿装1~1.5mL在火焰喷灯上封口,封口处要完全封闭,圆滑无勾。冷冻管要将盖子盖紧,并标记好细胞名称和冻存日期,同时作好登记(日期、细胞种类及代次、冻存支数)。

      (4)将装好细胞的安瓿或冻存管装入沙布袋内;置于液氮容器颈口处存放过夜,次日转入液氮中。采用控制降温速度的方法也可采用下列步骤:先将安瓿置入4℃冰箱中2~3小时,再移至冰箱冷冻室内3~4小时(此步可省略),再吊入液氮容器颈气态部分存放2小时,最后沉入液氮中。

      2. 分布降温法

      细胞系冻存程序:

      1) 单层细胞的消化。将经24~48小时培养已长成单层的传代细胞培养物弃去生长液,加适量ATV,1~2分钟后倒弃ATV,再加入少量ATV液,经0.5~1分钟倒去ATV,室温或37oC温箱作用2~3分钟,视细胞解离情况,拍打细胞培养瓶。使单层细胞完全解离。SP2/0瘤细胞,待生长好后用吸管吹打,再经1 000转/ 分离心lO分钟。

      2) 离心洗涤:向培养瓶内加5~1 0m1预冷的MEM使细胞悬浮,再将其吸出置灭菌离心管中,以1 000rpm 离心8~10分钟后弃去上清液。

      3) 细胞悬液的制备:向离心管内逐滴缓慢加入预冷的冻存保护液,使细胞浓度为150~400万/ml,然后迅速分装于安瓿瓶中,每瓶加量为lml。

      4) 致冷冻结:将安瓿瓶放入带有棉垫的纸盒或塑料盒内,直立置不同条件下致冷冻结果保存:

      a、4oC两小时后移至一2OoC作用2小时,再移入一4OoC4小时后在一7OoC下24小时投入液氮。

      b, 一20oC4小时后移致一4OoC。C经4小时移人一7OoC冰箱24小时,投入液氮。

      c, 一4OoC4小时后移入一70oC24小时后投入液氮。

      d、一20oC4小时后移入一70oC经24小时后投入液氮中。

      e、一70oC24小时后投入液氮中。

      5) 液氮中保存:将冻结后的安瓿装入预冷的小布袋中,投入液氮。为防止安瓿漂浮,可预先在小布袋中加入几块小卵石。

      3. 玻璃化法

      玻璃化保存(Vitrification)是一种超速冷冻方法。它是以极快的速度冷冻细胞,使细胞内外的游离水迅速形成玻璃样物质,而不形成冰晶。这种保存方法既避免了由于慢速降温时导致的盐浓度升高,又防止了由于冰晶形成造成的物理损伤,可获得较高存活率。

      玻璃化首先由Luyet在1937年提出,他认为生命是生物活体系统的原子或其他结构元的一种特殊排列.并且轻微的排列位置扰动就会破坏平衡从而导致死亡,而结冰时的驱动力会破坏这种特殊的排列,这就是冰冻死亡的原因。玻璃

      化比冻结固化方法引起的结构变化要小,因而是一种较理想的低温保存途径。

      1981年,Fahy首先明确提出,用高浓度的低温保护剂溶液,可在较慢地冷却速率以及高压条件下实现完全的玻璃化,以后又发展了一些所谓“玻璃化溶液”,使细胞、组织乃至器官等范围广泛的生物系统玻璃化低温保存成为可能。

      1985年,Rail和Fahy[ 目用这种玻璃化溶液使鼠胚胎玻璃化保存获得成功,是这种技术走向实用化的首次突破。

      复苏技术

      1. 细胞复苏的原则

      在实际操作中,冻存细胞要进行复苏,再培养传代。复苏细胞一般采用快速融化法。以保证细胞外结晶快速融化,以避免慢速融化水分渗入细胞内,再次形成胞内结晶损伤细胞。

      2. 细胞复苏的主要操作步骤

      (1)佩戴眼镜和手套,从液氮罐中取出安瓿或冷冻管。

      (2)迅速放入38℃水浴中,并不时摇动,在1分钟内使其完全融化,然后在无菌下取出细胞。

      (3)在1000r/min速度下离心5~10分钟,弃去上层液,加入适量培养液后接种于培养瓶中,接种浓度1×109/L,置37℃温箱静置培养,次日更换一次培养液,继续培养,观察生长情况。若细胞密度较高,及时传代。或无需离心直接将细胞加入瓶中,并加入培养基贴壁培养12~24小时后,充去上清,换入新鲜培养基继续培养。

      3. 注意事项

      在细胞复苏操作时,应注意融化冻存细胞速度要快,可不时摇动安瓿或冷冻管,使之尽快通过最易受损的温度段(-5~0℃)。这样复苏的冻存细胞存活率高,生长及形态良好。然而,由于冻存的细胞还受其他因素的影响,有时也会有部分细胞死亡。此时,可将不贴壁、飘浮在培养液上(已死亡)的细胞轻轻倒掉,再补以适量的新培养液,也会获得较为满意的结果。

     

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