质粒DNA提取实验步骤

中国教育装备采购网2013-11-12 11:00围观184次我要分享

  质粒DNA提取可以:(1)快速纯化质粒;(2)用于测序、体外转录与翻译、限制性内切酶消化、细菌转化等分子生物学实验。实验方法原理 质粒多为一些双链、环状的DNA分子,是独立于细菌染色体之外进行复制和遗传的辅助性遗传单位。质粒是进行分子生物学实验操作,进行遗传工程改良物种等工作时最主要的DNA载体。

  提取质粒的基本步骤分为三步:

  ①细菌的培养和质粒的扩增

  ②细菌菌体的裂解

  ③质粒DNA的纯化

  实验材料 大肠杆菌

  试剂、试剂盒 Tris-Hcl EDTA 葡萄糖 NaOH KAac NaAc 异丙醇 溶菌酶 酚:氯仿 无水乙醇 LB培养基

  仪器、耗材 超净工作台 培养箱 摇床 恒温水浴锅 台式离心机 取液器 低温冰箱 冷冻真空干燥机 电泳仪 水平电泳槽 紫外观测仪

  实验步骤 一、材料与试剂准备

  1. 材料:大肠杆菌。

  2. 仪器:超净工作台,培养箱,摇床,恒温水浴锅,台式离心机,取液器一套,低温冰箱,冷冻真空干燥机,电泳仪,水平电泳槽,紫外观测仪。

  3. 试剂:

  (1)Solution I :25 mM Tris-Hcl(pH7.4),10 mM EDTA(pH8.0),50 mM葡萄糖,高压灭菌,4℃保存。

  (2)Solution II :0.2 M NaOH, 1%SDS 现配现用。

  (3)Solution III :5 N KAc pH4.8,高压灭菌,4℃保存。

  (4)3 M NaAc pH5.2,高压灭菌,4℃保存。

  (5)异丙醇,溶菌酶(8 mg/ml),酚/氯仿,无水乙醇,70%乙醇,LB培养基,电泳试剂。

  二、操作步骤

  1. 细菌繁殖:LB培养基,2 ml/20 ml,37℃,200 rpm,摇一摇,过夜。

  2. 离心10 min,5 000 rpm, 4℃;弃上淸液。

  3. 沉淀(菌体细胞)预冷的TES缓冲液洗涤,离心10 min,5 000 rpm, 4℃,加入预冷的1 ml Solution I,冰浴10 min。

  4. 重新悬浮,加入150 ul溶菌酶母液,室温放置5 min。

  5. 加入1.2 ml Solution II, 冰浴5 min。

  6. 加入0.9 ml预冷乙酸钾,混匀,离心10 min,12 000 rpm,4℃。

  7. 加入1.5 ml异丙醇,-20℃冰箱内放置15 min。

  8. 离心10 min,12 000 rpm,4℃。

  9. 取沉淀,悬于400 ul TE缓冲液中。

  10. 加入40 ul,3 M NaAc。

  11. 酚/氯仿,抽提,乙醇沉淀。

  12. 离心10 min,12 000 rpm,4℃。

  13. 取沉淀,冷冻干燥,再悬浮于50 ul TE缓冲液中。

  14. 电泳检测提取DNA的质量。

来源:上海卡努生物科技有限公司作者:上海卡努生物科技有限公司

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