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  • 从外周血淋巴细胞中提取RNA

    中国教育装备采购网2013-12-19 13:52围观154次我要分享

      试剂、试剂盒 1. Ficoll(Amersham Biosciences)2.冰冷磷酸盐缓冲液(PBS),pH 7.43. 裂解缓冲液:5mol/L单巯基氰酸胍,10mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA),50mm

      仪器、耗材 1. 30m1Corex管,酸洗并硅化2. 预冷离心机和吊桶式转头

      实验步骤 1.收集新鲜人血液并立即用Ficoll分离白细胞。

      2.用冰冷PBS洗涤外周血淋巴细胞3次。

      3.在50ml塑料离心管中收集外周血淋巴细胞,并加入7ml裂解缓冲液(可溶解达到5×108个外周血淋巴细胞),然后剧烈涡旋振荡以溶解细胞。

      4.加入7体积(49m1)4mol/L氯化锂,4℃孵育15~20小时(过夜)。

      5.将悬液转移到30mlCorex管内,在吊桶式转头内4℃离心2小时,6500r/min。

      6.弃去上清,并用Kimwipe擦拭试管口。用3mol/L氯化锂(大约15ml)重悬,收集沉淀.将沉淀重悬液离心,6500r/min1小时。

      7.弃去上清,用2m1RNA溶解液溶解沉淀。在-20℃下,彻底冷冻悬液。

      8.复溶悬液,每10分钟涡旋20秒,共45分钟。

      9.用等体积酚抽提1次,并用等体积氯仿抽提1次。

      10.加入1/10体积的3mol/L乙酸钠,pH 4.8和2体积一20℃乙醇。彻底混合溶液,并在-20℃下孵育过夜。

      11.在吊桶式转头内离心RNA,12000r/min30分钟。用0.2m1DEPC处理水重悬沉淀。将溶解的DNA转移至1.5m1微量离心管内,并加入1/10体积3mol/L乙酸钠,pH 4.8和2体积-20℃乙醇,重新沉淀。并以乙醇沉淀物形式保存RNA,直至准备使用时。

     

    来源:上海创赛科学仪器有限公司作者:上海创赛科技有限公司
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