植物组织中丙二醛含量的测定

中国教育装备采购网2014-02-10 09:13围观134次我要分享

  实验原理丙二醛(MDA)是常用的膜脂过氧化指标,在酸性和高温度条件下,可以与硫代巴比妥酸(TBA)反应生成红棕色的三甲川(3,5,5-三甲基恶唑2,4-二酮),其最大吸收波长在532nm。但是测定植物组织中MDA时受多种物质的干扰,其中最主要的是可溶性糖,糖与TBA显色反应产物的最大吸收波长在450nm,532nm处也有吸收。植物遭受干旱、高温、低温等逆境胁迫时可溶性糖增加,因此测定植物组织中MDA—TBA反应物质含量时一定要排除可溶性糖的干扰。低浓度的铁离子能够显著增加TBA与蔗糖或MDA显色反应物在532、450nm处的消光度值,所以在蔗糖、MDA与TBA显色反应中需一定量的铁离子,通常植物组织中铁离子的含量为100~300μg/g DW,根据植物样品量和提取液的体积,加入Fe3+的终浓度为0.5μmol/L。

  A. 直线回归法

  MDA与TBA显色反应产物在450nm波长下的消光度值为零。不同浓度的蔗糖(0~25mmol/L)与TBA显色反应产物在450nm的消光度值与532nm和600nm处的消光度值之差成正相关,配制一系列浓度的蔗糖与TBA显色反应后,测定上述三个波长的消光度值,求其直线方程,可求算糖分在532nm处的消光度值。UV-120型紫外可见分光光度计的直线方程为:

  Y532=﹣0.00198+0.088D450 ①

  B.双组分分光光度计法

  据朗伯-比尔定律:D=kCL,当液层厚度为1cm时,k=D/C,k称为该物质的比吸收系数。当某一溶液中有数种吸光物质时,某一波长下的消光度值等于此混合液在该波长下各显色物质的消光度之和。

  已知蔗糖与TBA显色反应产物在450nm和532nm波长下的比吸收系数分别为85.40,7.40。MDA在450nm波长下无吸收,故该波长的比吸收系数为0,532nm波长下的比吸收系数为155,根据双组分分光度计法建立方程组,求解方程得计算公式:

  C1(mmol/L)=11.71D450 ②

  C2(μmol/L)=6.45(D532-D600)-0.56D450 ③

  式中 C1-为可溶性糖的浓度;

  C2-为MDA的浓度;

  D450、D532、D600分别代表450nm、532nm和600nm波长下的消光度值。

  实验试剂10%三氯乙酸(TCA);0.6%硫代巴比妥酸,先加少量的氢氧化钠(1mol/L)溶解,再用10%的三氯乙酸定容;石英砂。

  实验设备紫外可见分光光度计1台;离心机1台;电子天平1台;10ml离心管4支;研钵两套;试管4支;刻度吸管:10ml 1支,2ml 1支;剪刀1把。

  实验材料受干旱、高温、低温等逆境胁迫的植物叶片或衰老的植物器官实验步骤 1. 实验材料 受干旱、高温、低温等逆境胁迫的植物叶片或衰老的植物器官。

  2. MDA的提取 称取剪碎的试材1g,加入2ml 10%TCA和少量石英砂,研磨至匀浆,再加8ml TCA进一步研磨,匀浆离心(4000×g)10min,上清液为样品提取液。

  3. 显色反应和测定 吸取离心的上清液2ml(对照加2ml蒸馏水),加入2ml 0.6%TBA溶液,混匀物于沸水浴上反应15min,迅速冷却后再离心。取上清液测定532nm、600nm和450nm波长下的消光度。

  4. 计算含量

  (1) 直线方程法 按公式①求出样品中糖分在532nm处的消光度值Y532,用实测532nm的消光度值减去600nm非特异吸收的消光度值再减去Y532,其差值为测定样品中MDA-TBA反应产物在532nm的消光度值。按MDA在532nm处的毫摩尔消光系数为155换算求出提取液中MDA浓度。

  (2) 双组分分光光度法 按公式③可直接求得植物样品提取液中MDA的浓度。

  用上述任一方法求得MDA的浓度,根据植物组织的重量计算测定样品中MDA的含量:

  MDA(μmol/g FW)= (MDA浓度(umol/L)*提取液体积(ml))) / 植物组织鲜重(g)

  注意事项1. 0.1-0.5%的三氯乙酸对MDA—TBA反应较合适,若高于此浓度,其反应液的非专一性吸收偏高;

  2. MDA-TBA显色反应的加热时间,最好控制沸水浴10-15min之间.时间太短或太长均会引起532nm下的光吸收值下降;

  3. 如待测液浑浊,可适当增加离心力及时间,最好使用低温离心机离心.

  4. 低浓度的铁离子能增强MDA与TBA的显色反应,当植物组织中铁离子浓度过低时应补充 Fe3 (最终浓度为0.5 nmol·L-1)

  5. 可溶性糖与TBA显色反应的产物在532 nm也有吸收(最大吸收在450 nm),当植物处于干旱,高温,低温等逆境时可溶性糖含量会增高,必要时要排除可溶性糖的干扰.

 

来源:卡迈舒(上海)生物科技有限公司.作者:卡迈舒(上海)生物科技有限公司

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