月初雨又来:让上海恒远陪您通过免疫共沉淀来确定结合蛋白

中国教育装备采购网2014-03-04 17:01围观165次我要分享

  今儿个就是雨天,新的一周不过刚刚开始,马上让人觉得又过了一半,时间如此之快,朋友们,不抓紧时间学习可不行呀。月初雨又来:让上海恒远陪您通过免疫共沉淀来确定结合蛋白。

  免疫共沉淀的优、缺点

  优点:1、蛋白的相互作用是在自然状态下进行的,可以避免人为的影响。

  2、可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。

  3、相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的,处于天然状态。

  缺点:1、可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质-蛋白质相互作用;

  2、必须在实验前预测目的蛋白是什么,以选择最后检测的抗体,所以,若预测不正确,实验就得不到结果,方法本身具有冒险性;

  3、两种蛋白质的结合可能不是直接结合,而可能有第三者在中间起桥梁作用。

  下面是恒远生物为朋友们整理出的通过免疫共沉淀确定结合蛋白步骤方法:

  1、用磷酸盐缓冲液洗30块10 cm培养板上的适宜细胞。刮去每块板上的细胞到1 ml冰冷的EBC裂解缓冲液中;

  2、将每毫升细胞悬液转移到微量离心管中,在微量离心机上4℃以最大速度离心15 ;

  3、收集上清(约30 ml)并加入30 μg的适当抗体,4℃摇动免疫沉淀物1 h;

  4、加入0.9 ml的蛋白质A-Sepharose 悬液,4℃摇动免疫沉淀物30 min;

  5、用含900 mmol/L NaCl的NETN洗蛋白A-Sepharose混合物,再重复洗5次。最后,用NETN洗一次;

  6、吸出混合物的液体部分。加入800 μl的1×SDS胶加样缓冲液到球珠中,煮沸4 min;

  7、将样品加入到大孔的不连续SDS-PAGE梯度胶中,在10 mA的恒定电流下电泳过夜;

  8、通过考马斯亮蓝染色观察蛋白质泳带;

  9、从胶上切下目标带,将其放到微量离心管中,用1 ml 50%乙腈洗两次,每次3 min;

  10、用胰蛋白酶消化胶中的蛋白质,再将肽电洗脱;

  11、通过窄孔高效液相色谱分离肽。将收集的肽在ABI 477A或494A机器上进行自动Edman降解测序。

  看到这里就已经结束啦,如果您还有什么不懂的地方欢迎来电咨询我公司哦!上海恒远产品的质量是绝对高的,并且价格也合理,近期还有优惠活动哦!

 

来源:上海恒远生物科技有限公司作者:上海恒远生物科技有限公司

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