质谱的试剂用品、实验操作、仪器和样品选择方法

中国教育装备采购网2014-03-24 13:52围观203次我要分享

质谱法在蛋白分析鉴定等实验中具有不可忽视的作用,本文对其中的样本制备试剂用品、实验操作、质谱仪的选择、样品的选择等方面进行详细的介绍。另外,这方面的FAQ、著名网站等信息可点击蓝色的字体查看。

用具仪器:

真空干燥仪、水浴锅、10μ和200μ移液器、废液缸、制冰和装冰设备、200μ管架、剪刀、能装放置了200μ管管架的塑料盒、200μ管离心机。

准备:

1. 0.2ml EP管三套,MilliQ水和甲醇各涮一遍,真空干燥。

2. 50ml EP管六支,MilliQ水和甲醇各涮一遍,真空干燥。

3. 胰酶储液制备:使胰酶粉末沉落瓶底,用100μ胰酶重旋液溶解,用0.5ml EP分装成5μl。

4. 50ml 100 mM NH4HCO3。

脱色酶切:

1. 切点将200μl tip头剪成吸口1.5mm左右的直径,MilliQ水涮洗一遍,吸100μl水后戳取斑点,将胶粒打入0.2ml EP管中,吸干水后再用MilliQ水洗涤两遍,吸干。

2. 脱色 180μl 50%MeOH/50mM NNH4HCO3脱色两次以上,每次半小时;180μl MilliQ水洗涤5分钟,180μ 50% ACN洗涤5分钟,180μl 100%ACN洗涤5分钟;真空干燥半小时。

3. 酶切

① 25 mMNH4HCO3稀释胰酶至12.5μg/μl;每管胶粒加入胰酶3μl,冰浴15分钟后洗掉多余的胰酶;再加入3μl左右25 mM NH4HCO3至覆盖胶粒。

② 小心将EP管倒转,将整个EP管架放入塑料盒中后放入37度水浴锅酶切16小时。

③ 将塑料盒从37度水中捞出,注意不要倒掉水,冷却至室温。

④ 加入10μl 25 mMNH4HCO3,震荡15分钟,离心后收集至新管;

加入10μl 2.5%TFA,震荡5分钟,收集至上管;

加入10μl2.5%TFA-50% ACN,震荡5分钟,收集至上管;

加入10μl 100% ACN,震荡5分钟,收集至上管。

⑤ 将此收集液真空浓缩至5-10μl后,加入20μl 0.5%TFA;继续浓缩至10-20μl。

肽段浓缩除盐:

1. 吸10μl 100% ACN,弃之,重复两次;

2. 吸10μl 0.1% TFA,弃之,重复两次;

3. 吹吸样本15次;

4. 吸10μl 0.1% TFA,弃之,重复两次;

5. 吸3μl 0.1% TFA-50% ACN,将此洗脱液转入新EP管。

质谱种类

质谱仪种类非常多,工作原理和应用范围也有很大的不同。从应用角度,质谱仪可以分为下面几类:

有机质谱仪:由于应用特点不同又分为:

① 气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)在这类仪器中,由于质谱仪工作原理不同,又有气相色谱-四极谱仪,气相色谱-飞行时间质谱仪,气相色谱-离子阱质谱仪等。

② 液相色谱-质谱联用仪(LC-MS)同样,有液相色谱-四器极质谱仪,液相色谱-离子阱质谱仪,液相色谱-飞行时间质谱仪,以及各种各样的液相色谱-质谱-质谱联用仪。

③ 其他有机质谱仪,主要有:基质辅助激光解吸飞行时间质谱仪(MALDI-TOFMS),富立叶变换质谱仪(FT-MS)

无机质谱仪,包括:

① 火花源双聚焦质谱仪。

② 感应耦合等离子体质谱仪(ICP-MS)。

③ 二次离子质谱仪(SIMS)

但以上的分类并不十分严谨。因为有些仪器带有不同附件,具有不同功能。例如,一台气相色谱-双聚焦质谱仪,如果改用快原子轰击电离源,就不再是气相色谱-质谱联用仪,而称为快原子轰击质谱仪(FAB MS)。另外,有的质谱仪既可以和气相色谱相连,又可以和液相色谱相连,因此也不好归于某一类。在以上各类质谱仪中,数量最多,用途最广的是有机质谱仪。

 

除上述分类外,还可以从质谱仪所用的质量分析器的不同,把质谱仪分为双聚焦质谱仪、四极杆质谱仪、飞行时间质谱仪、离子阱质谱仪、傅立叶变换质谱仪等。

质谱仪的选择窍门

质谱仪种类繁多,不同仪器应用特点也不同,一般来说,在300C左右能汽化的样品,可以优先考虑用GC-MS进行分析,因为GC-MS使用EI源,得到的质谱信息多,可以进行库检索。毛细管柱的分离效果也好。如果在300℃左右不能汽化,则需要用LC-MS分析,此时主要得分子量信息,如果是串联质谱,还可以得一些结构信息。如果是生物大分子,主要利用LC-MS和MALDI-TOF分析,主要得分子量信息。对于蛋白质样品,还可以测定氨基酸序列。质谱仪的分辨率是一项重要技术指标,高分辨质谱仪可以提供化合物组成式,这对于结构测定是非常重要的。双聚焦质谱仪,傅立叶变换质谱仪,带反射器的飞行时间质谱仪等都具有高分辨功能。

质谱分析法中的样品选择

质谱分析法对样品有一定的要求。进行GC-MS分析的样品应是有机溶液,水溶液中的有机物一般不能测定,须进行萃取分离变为有机溶液,或采用顶空进样技术。有些化合物极性太强,在加热过程中易分解,例如有机酸类化合物,此时可以进行酯化处理,将酸变为酯再进行GC-MS分析,由分析结果可以推测酸的结构。如果样品不能汽化也不能酯化,那就只能进行LC-MS分析了。进行LC-MS分析的样品最好是水溶液或甲醇溶液,LC流动相中不应含不挥发盐。对于极性样品,一般采用ESI源,对于非极性样品,采用APCI源。

来源:上海创赛科学仪器有限公司作者:上海创赛科技有限公司

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