植物细胞骨架的显示及光镜观察

中国教育装备采购网2014-05-13 09:13围观1041次我要分享

实验原理

 细胞内由微丝、微管、中间纤维等交织形成一个十分复杂的立体网络结构。它们对于细胞形状的保持、细胞内物质运输、细胞运动、细胞内各结构相对位置的固定都有重要作用,故而称为细胞骨架。
 
      
细胞骨架在通常固定条件下不稳定,如低温、高压、酸处理等。当采用适当的手段,如M-缓冲液洗涤细胞,可以提高细胞骨架的稳定性,戊二醛在室温下固定能较好的保存细胞骨架的成分,另外,Triton X-100处理能抽取掉一部分 杂蛋白,可使骨架成分显现的更加清晰。
 
      
微丝、微管、中间纤维等都是直径很小的结构。最大的单根微管才25nm左右,只能在电镜下才能看见,目前研究细胞骨架的主要方法是应用高压电镜或免疫荧光显微技术,本实验用普通光镜观察到细胞骨架,是因为骨架纤维成束分布,结构经染色以后,有夸大作用。由于细胞经Triton X-100提取剩下的主要成分是细胞骨架成分,使得显现等价清晰。

实验试剂

M-缓冲液(配制方法如下):
        咪唑              2.90g
        KCl               3.70g              MgCl2            0.012g
        EGTA             0.38g               EDTA            0.042g
      巯基乙醇     0.086ml        加水到          1000 ml                   
6mM磷酸缓冲液
        KH2PO4                         0.74g 
        Na2HPO4?12H2O            2.4g
        加水到                   1000 ml
        
1%Triton X-100:以M-缓冲液配制
       
3%戊二醛: 25%戊二醛  12 ml   6nm磷酸缓冲液   88 ml  
               
染料: 考马斯亮蓝 R-250     0.2g     冰醋酸        7 ml                                                 
甲醇                              46.5 ml     蒸馏水             46.5 ml

实验设备

   器材:显微镜、烧杯、吸管、镊子、载片、盖片

实验材料

   材料:洋葱鳞茎

实验步骤

1.撕取洋葱鳞茎内表皮表皮细胞(约1cm2)若干片置于盛有6mH  pH6.8磷酸缓冲液中,使其下沉。
 
2.吸去磷酸缓冲液,加入1%Triton X-100处理20-30分钟
3.吸去Triton X-100,用M-缓冲液洗三次,每次三分钟。
 
4.3%戊二醛固定30-60分钟。
 
5.pH6.8磷酸缓冲液洗三次,每次十分钟。
 
6.0.2%考马斯亮蓝 R-250染色20-30分钟。
 
7.用蒸馏水洗1-2次,细胞置于载玻片上,加盖玻片,于普通光学显微镜下观察,就可以看到由微丝、微管组成的网络。
来源:卡迈舒(上海)生物科技有限公司作者:卡迈舒(上海)生物科技有限公司

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