植物组培污染完美解决方案

中国教育装备采购网2014-07-10 11:26围观1316次我要分享

植物组培广泛应用于植物科研,如模式植物,作物育种等,工厂化生产,如观赏花卉植物,中药材生产,园林园艺等,但是组培过程中种苗的污染是广大工作者最头疼的问题,尤其是真菌污染,常用的抗生素根本无法有效的抑制和清除,来自美国Plant cell Technology公司的专家针对这一问题,研发了一款高效的植物组培微生物污染清除试剂——PPM(Plant Preservative Mixture),该产品能非常有效的抑制和清除组培过程中产生的污染问题,且无需过滤灭菌,能直接与培养基一同高压灭菌,使用非常方便,此项发明也申请了专利:

产品专利说明:

PPMTM - Plant Preservative Mixture是专利产品,其商品名称,配方及使用方法等都受专利保护,专利号5,750,402。


产品名称:PPMTM - Plant Preservative Mixture(植物组织培养抗菌保护剂)

货号:PPM

保存条件:4o C

运输条件:常温

物理性质:溶液

性状无色至琥珀色透明液体

pH3.8

有效期见瓶身标签说明

产品描述:

1.         PPMTM 是一种热稳定的抗菌剂,用于植物组织培养中植物的微生物污染防治与清除;

2.         在合理的使用剂量下,PPMTM是一种非常有效的植物组培抗菌剂与保护剂,不会对植物的生长(如种子萌发,愈伤增殖、再生等)产生任何影响,可视为培养基标准配方成份;

3.         PPMTM主要用于预防和消除来自空气、水源或者人体接触等外界因素导致的植物组培过程中的微生物污染,同时,对于植物内生菌也同样具有非常好的抑制效果;

4.         PPMTM广泛适用于绝大多数被子植物和裸子植物,但是不推荐用于蕨类植物、藻类等水生植物;

5.         PPMTM具有热稳定性,能直接加入培养基高温灭菌而不会影响使用效果,使用更加方便;

6.         PPMTM 相对于常规抗生素而言,性价比更高。

作用机理

PPMTM的活性成分能渗透细菌或者真菌细胞壁,抑制呼吸作用中三羧酸循环和电子传递链过程中关键酶的活性,同时,也能阻断细菌和真菌吸收和利用培养基中单糖和氨基酸的过程,从而实现预防和清除植物组织培养过程中的微生物污染。

相对抗生素的优势:

1.         PPM TM能广泛抑制和清除细菌和真菌的污染,并防止真菌孢子的萌发;

2.         PPM TM是通过抑制多种酶的活性而达到抑菌效果,从而能避免耐药突变体的发生;

3.         PPM TM具有热稳定性,无需过滤灭菌,能直接加入培养基高温灭菌而不会影响使用效果,使用更加方便;

4.         PPM TM性价比更高,可更加广泛的应用于更多的科学研究、作物育种、组培苗工厂化生产中。

 

 

常规使用简介:

以下使用指南是针对大多数情况下的常规使用说明,特殊情况可做适当调整。

使用指南

污染预防

消毒灭菌

抑制农杆菌

浓度 (v/v)

0.05 – 0.2%

5.0% (see note)

0.05%

处理时间

持续

4 – 12 hours

持续

说明

1. 具体使用浓度根据处理样本有所不同;
2.原生质体和愈伤组织处理浓度建议为0.05%;

1. 将组织加入到含5%PPM?的3X MS*盐溶液中,搅拌4-12小时;
2. 处理过程中无需其他灭菌方法同时使用,不能添加酸碱试剂,调节pH,也不要加入Tween20等;

3.处理完成以后将组织转移到含0.05%PPM的培养基中;

与其他抗生素配合使用效果更佳

*说明:MS盐溶液是泛指,如样本的培养基盐溶液不是MS盐,以具体适用的培养基盐溶液为准;

操作说明:

以下操作说明是针对大多数情况下的常规使用说明,必要时,可根据具体植物样本情况进行适当调整,如需更多指导可联系Dr. Assaf Guri at guri1@erols.com

1.      常规用量:
一般推荐使用使用浓度为0.05%-0.2%(1L培养基中加入0.5-0.75ml PPM?),愈伤增殖,器官形成,胚性组织发育等使用浓度为0.05%-0.075%。

说明:
(a) 含有PPM?的培养基无需在超净工作台中分装,在培养基凝固以后将培养瓶/皿盖子盖  

好即可。如使用自动灌装系统,建议在灌装前后将分装管用高压灭菌热水处理;
(b) 如果培养基储存液保存在无菌容器中并未经污染的情况下,加入PPM?配制的培养基

无需再次过滤或者高温灭菌。如果是营养培养基,如含有200mg/L甚至更高浓度氨基酸或者蛋白质的培养基,建议过滤灭菌。

2.      植物内生菌污染处理

(a) 种子:PPM?不推荐用于直接处理含有大量的细菌或真菌孢子的种子灭菌,对于种子离体萌发,建议先采用传统方法消毒,然后置于含2-3%PPM?的全培养基础盐溶液中,轻轻搅拌4-12小时,此过程千万不能添加Tween20和调节pH,处理完成以后直接插入含有PPM?(草本植物0.05-0.1%,木本植物0.2%)的培养基里;

(b) 外植体:以1cm外植体为例,将外植体置于含4-5%PPM?的全培养基础盐溶液中,轻轻搅拌4-12小时,此过程千万不能添加Tween20和调节pH,处理完成以后直接插入含有PPM?(草本植物0.05-0.1%,木本植物0.2%)的培养基里;

(c) 对于块茎,球茎和鳞状物的观赏植物样本:将其整体放入消毒剂中搅拌消毒处理以后,用水冲洗干净,将材料切成薄片,置于含4-5%PPM?的全培养基础盐培养液中,轻轻搅拌4-12小时,此过程千万不能添加Tween20和调节pH,处理完成以后无需冲洗直接插入含有0.1-0.2%的PPM?的培养基里进行培养。

 

3.      如果厚的外植体、污染严重的植株、种子等样本经过以上处理仍得不到理想效果,可尝试以下操作:

(a) 将材料浸泡在水中持续搅拌处理(松软组织搅拌1小时,硬实组织搅拌2小时);

(b) 将材料在含50%的PPM?全培养基础盐溶液中搅拌处理5-10分钟,此过程千万不能添加Tween20和调节pH;

(c) 无需冲洗,将处理过的材料直接加入到培养基中即可。对于真菌污染,可在培养基中加入适当浓度的PPM?。对于真菌细菌混合性污染,建议在培养的第一个月的培养基中加入0.05%-0.2%的PPM?。

4.      严重污染材料污染去除与抢救(重污染不超过一周):

(a) 将污染的材料至于流水中用软刷刷洗,然后置于含50% PPM?的无菌水溶液中搅拌5-15分钟,对于细菌或者混合性污染,建议使用100% PPM?与0.6g/L的柠檬酸无菌水溶液按1:1混合的低pH(2.8-3.2)的酸性溶液处理;

(b) 处理后的材料无需清洗,直接插入含0.05%-0.25的PPM?的培养基中培养至少一个月以上,其中前10天需要弱光培养;

对于一些真菌、孢子和细菌污染隐藏较深,PPM?无法接触到的部位,建议在初步的清洗以后,将材料切开,然后再放入含50%PPM?的无菌水溶液中搅拌5-15分钟处理。

5.      农杆菌的去除:

共培养以后,将样本用无菌水清洗,然后将样本浸没在100% PPM?(补充4X的培养基盐溶液)中处理2分钟,取出后用无菌纸吸干后并置于常用抗性培养基中培养,3周后,更换到只含有0.05%-0.075% PPM?(无常用抗生素)的培养基中培养。

使用注意事项

1.     在所有PPM?消毒处理外植体的过程中,尽量保证容器的体积足够大,并使外植体材料所有面积与含PPM的处理溶液充分接触,以保证消毒效果;

2.     如果外植体出现高度氧化现象,不要扔弃,大约50%的外植体在4-6周内即可恢复;

3.      50% PPM? 的处理溶液可以重复使用但是不推荐,因为使用次数和效果受外植体的体积与接种密度的影响。将50% PPM? 的处理溶液保存在4oC 可适当延长其活性,一般可使用不超过10次。如果必要,建议配制2份50% PPM? 溶液,一份用于外植体消毒内生菌污染,另一份用于消除“培养过程中”的轻度污染材料抢救,第二份溶液在每次处理过后需要用0.2mm滤器过滤;

4.      如果50% PPM? 溶液处理效果不理想,可采用100% PPM? 溶液进行处理,处理方法相同,但使用次数不得超过10次。

安全说明:

1.      虽然PPM?是无毒性的,但是在使用过程中还需尽量避免直接与人体皮肤等直接接触,建议使用时佩戴手套,保持空间空气流通,如不慎吸入,先马上因大量纯净水后立即就医,如不慎入眼,立刻用大量水冲洗眼睛15分钟,用肥皂清洗PPM?接触过的皮肤部位;

2.      含PPM?的培养基垃圾处理与常规培养基处理方法相同。


来源:北京西美杰科技有限公司作者:北京西美杰科技有限公司

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