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  • 用离心机提取植物基因组DNA

    中国教育装备采购网2014-07-15 11:07围观1162次我要分享我要投稿

    一、材料

     幼嫩叶子。

    二、设备

    移液器,冷冻高速离心机,台式高速离心机,水浴锅,陶瓷研钵,50ml离心管(有盖)及5ml和1.5ml离心管,弯成钩状的小玻棒。

     三、试剂

    1、提取缓冲液Ⅰ:100mmol/LTris·Cl, pH8.0, 20mmol/L EDTA, 500mmol/L NaCl, 1.5% SDS。

    2、提取缓冲液Ⅱ:18.6g葡萄糖,6.9g二乙基二硫代碳酸钠,6.0gPVP,240ul巯基乙醇,加水至300ml。

    3、80:4:16/氯仿:戊醇:乙醇

    4、 RnaseA母液

    5、其它试剂:液氮、异丙醇、TE缓冲液,无水乙醇、70%乙醇、3mol/LNaAc。

    四、操作步骤:

    1. 在50ml离心管中加入20ml提取缓冲液Ⅰ, 60℃水浴预热。

    2. 幼苗或叶子5-10g, 剪碎, 在研钵中加液氮磨成粉状后立即倒入预热的离心管中, 剧烈摇动混匀, 60℃水浴保温30-60分钟(时间长,DNA产量高), 不时摇动。

    3. 加入20ml氯仿/戊醇/乙醇溶液, 颠倒混匀(需带手套, 防止损伤皮肤),室温下静置5-10分钟, 使水相和有机相分层(必要时可重新混匀)。

    4. 室温下5000rpm离心5分钟。

    5. 仔细移取上清液至另一50ml离心管,加入1倍体积异丙醇,混匀,室温放置片刻即出现絮状DNA沉淀。

    6. 在1.5ml eppendorf中加入1ml TE。用钩状玻璃棒捞出DNA絮团,在干净吸水纸上吸干,转入含TE的离心管中,DNA很快溶解于TE。

    7. 如DNA不形成絮状沉淀,则可用5000rpm离心5分钟, 再将沉淀移入TE管中。这样收集的沉淀,往往难溶解于TE,可在60℃水浴放置15分钟以上,以帮助溶解。

    8. 将DNA溶液3000rpm离心5分钟, 上清液倒入干净的5ml离心管。

    9. 加入5μl RNaseA(10μg/μl), 37℃ 10分钟, 除去RNA(RNA对DNA的操作、分析一般无影响,可省略该步骤)。

    10. 加入1/10体积的3mol/LNaAc及2×体积的冰乙醇,混匀,-20℃放置20分钟左右,DNA形成絮状沉淀。

    11. 用玻棒捞出DNA沉淀,70%乙醇漂洗,再在干净吸水纸上吸干。

    12. 将DNA重溶解于1ml TE,-20贮存。

    13. 取2μl DNA样品在0.7%Agarose胶上电泳, 检测DNA的分子大小。同时取15μl稀释20倍, 测定OD260/OD280, 检测DNA含量及质量。

    [注意] 5g样品可保证获得500μg DNA, 足供RFLP、PCR等分析之用。

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