真菌菌丝的总RNA的提取

中国教育装备采购网2014-10-10 14:50围观1017次我要分享

  试剂:

  RNA提取缓冲液(CTAB):2% CTAB(W/V),2% 聚乙烯吡咯烷酮PVP(W/V),100 mM Tris-HCl(pH8.0,DEPC处理的水配置),25mM EDTA, 0.5g/L 亚精胺Spermidine,2.0M NaCl,2%巯基乙醇(V/V,使用前加入)。由于在高温灭菌条件下,Tris-HCl要和DEPC发生反应,所以配RNA提取缓冲液时直接用DEPC 处理的水配制即可。

  SSTE:1 M NaCl,0.5% SDS(W/V),10 mM Tris-HCl pH8.0,1.0 mM EDTA

  10M LiCl 直接用蒸馏水配10M LiCl,加1‰的DEPC过夜后,高温灭菌。

  3M NaAc

  氯仿:异戊醇(24:1)

  酚(pH4.5):氯仿:异戊醇(25:24:1)

  DEPC处理水 用1‰的DEPC处理蒸馏水过夜,高温灭菌

  无水乙醇

  70%酒精

  方法

  1. 实验开始前将RNA提取液于65℃水浴锅中预热,离心管中加入ME(巯基乙醇)(10mL加80ul,50mL中加入300ul)。

  2.取约0.8g菌丝体(液体培养获得的菌丝用真空抽滤即可!固体培养就更好说了),在液氮中迅速磨成精细粉末,装入50 mL离心管,按1g材料8mL的量加入预热的RNA提取液,颠倒混匀。

  3. 65℃水浴3-10 min,期间混匀2-3次

  4. 加入等体积的酚(注意是酸酚pH4.5):氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提(10,000 rpm,4℃,5 min)

  5. 取上清,等体积的氯仿:异戊醇(24:1)抽提(10,000 rpm,4℃,5 min)

  6. 加入1/4V体积10M LiCl溶液,4℃放置6hr以上(或过夜)

  7. 10,000 rpm,4℃离心20 min

  8. 弃上清,用500 ulSSTE溶解沉淀

  9. 酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提两次,氯仿:异戊醇(24:1)抽提1次(10,000 rpm,4℃,5 min)

  10. 加2V体积的无水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30 min以上

  11. 12,000 rpm,4℃离心20 min

  12. 弃上清。沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

  13. 加200 ul的DEPC处理水溶解

  14. 用非变性琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计扫描检测RNA的质量

  (在抽提过程中,若蛋白质含量或其它的杂质还较多,可以增加抽提次数)

  注意:提取RNA请尽量在低温下操作,如果条件不容许,在室温下操作的时间要尽可能的短。

来源:上海创赛科学仪器有限公司作者:上海创赛科技有限公司

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