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  • 从动物肝脏中提取DNA

    中国教育装备采购网2014-10-29 09:26围观1036次我要分享我要投稿

      一、原理 :

      在浓氯化钠(1―2mol/L)溶液中,脱氧核糖核蛋白的溶解度很大,核糖核蛋白的溶解度很小,在稀氯化钠(0.14 mol/L)溶液中,脱氧核糖核蛋白的溶解度很小,核糖核蛋白的溶解度很大。因此,可利用不同浓度的氯化钠溶液,将脱氧核糖核蛋白和核糖核蛋白从样品中分别抽提出来。

      将抽提得的核蛋白用SDS(十二烷基硫酸钠)处理,DNA或(RNA)即与蛋白质分开,可用氯仿―异戊醇将蛋白质沉淀除去,而DNA则溶解于溶液中。向溶液中加入适量乙醇,DNA即析出。

      为了防止DNA或(RNA)酶解,提取时加入EDTA(乙二胺四乙酸)

      二、实验材料与仪器 :

      1、小白鼠肝脏

      2、匀浆器

      3、离心机5000r/min

      4、量筒50ml(×1),25 ml(×1),10 ml(×1)

      5、 吸管5 ml(×2)

      6、水浴锅

      7、真空干燥器

      三、试剂 :

      1.5 mol/L NaCl 溶液:将292.3g NaCl 溶于水,稀释至1000ml。

      2.0.14mol/L NaCl―0.15mol/L EDTA―Na 溶液: 溶8.18g NaCL 及37.2g EDTA―Na 于蒸馏水,稀释至1000ml。

      3.25% SDS 溶液: 溶25g 十二烷基硫酸钠于100ml 45% 乙醇

      4.0.015 mol/L NaCL―0.0015 mol/L 柠檬酸三钠溶液: 氯化钠 0.828 g及柠檬酸三钠0.341g 溶于蒸馏水,稀释至1000ml。

      5.氯仿―异戊醇混合液:氯仿:异戊醇=24:1(V/V)。

      6.1.5 mol/L NaCL―0.15 mol/L柠檬酸三钠溶液:氯化钠 82.8 g 及柠檬酸三钠34.1 g溶于蒸馏水,稀释至1000ml。

      7.3 mol/L乙醇钠―0.001 mol/L EDTA―Na溶液: 称取乙酸钠 408 g,EDTA―Na 0.372g 溶于蒸馏水,稀释至1000ml。

      8.70%乙醇,80%乙醇,95%乙醇,无水乙醇。

      9.二苯胺试剂

      10.1 mol/L过氯酸溶液:将10ml过氯酸(70%)用蒸馏水稀释至110ml。

      四、操作 :

      1. DNA的分离纯化:

      (1)将10头小白鼠迅速杀死,取出肝脏,用0.14mol/LNaCl―0.15mol/l EDTA溶液洗去血浆,剪碎,加入50ml0.14mol/L NaCl―0.15mol/lEDTA溶液,置匀浆器中研磨,待磨成糊状后,将糊状物离心10分钟(4000r/min),弃去上清液,沉淀用0.14mol/LNaCl―0.15mol/L EDTA溶液洗二、三次,所得沉淀为脱氧核糖核蛋白粗制品。

      (2)向上述沉淀物加入0.14mol/LNaCl―0.15mol/L EDTA溶液,使总体积为44ml,然后滴加25% SDS溶液 3ml,边加边搅拌,加毕,置60水浴保温10分钟(不停搅拌)溶液变的粘稠并略透明,取出冷至室温。此步操作是使核酸与蛋白质分离。

      (3)加入5mol/LNaCL10ml,使NaCl 最终浓度达到1mol/L,搅拌10分钟,加入月约一倍体积的氯仿―异戊醇混合溶液,振摇20分钟,离心10分钟(4000r/min)。去掉沉淀,上层清液徐徐加入1.5―2倍95%乙醇,DNA沉淀即析出,用玻棒慢慢搅动,则DNA丝状物即缠在玻棒上。

      (4)将DNA粗品置于27ml 0.015 mol/L NaCl ―0.0015 mol/L柠檬酸三钠溶液中,再加入3ml1.5 mol/L NaCl―0.15 mol/L柠檬酸三钠溶液,搅匀,加入一倍体积氯仿―异戊醇混合液,振摇十分钟,离心(4000r/min,10分钟),倾出上层液体(沉淀弃去),加入1.5倍体积95%乙醇,DNA即沉淀析出。离心,弃去上清液,沉淀(粗DNA)按本操作步骤重复处理一次。

      (5)将上步所得沉淀于27ml 0.015 mol/L NaCl―0.0015 mol/L柠檬酸三钠溶液中,然后以线状徐徐加入2倍95%乙醇,边加边搅,取出丝状DNA,依次用70%,80%,95%以及无水乙醇各洗一次,真空干燥。

      2. 鉴定: 用二苯胺法测定DNA。

    来源:上海创赛科学仪器有限公司作者:上海创赛科技有限公司我要投稿
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