做好免疫组化染色必须注意的问题

中国教育装备采购网2014-11-12 09:34围观1009次我要分享

  一、为达到免疫组织化学技术的要求,组织固定越新鲜越好。

  在免疫组化最后结果的判断时,常可见到均匀一片的似非特异性染色的现象,经多方研究认为,它是一种假性非特异性的染色。因为肿瘤组织中含有的抗原较易发生扩散弥散,肿瘤细胞无限制的生长和生长过速,导致肿瘤中间部分组织血液供给困难,造成缺血坏死,坏死细胞中的抗原由于机体的作用,可以被均匀地散布于细胞与细胞间的间质,这是抗原发生弥散的一种方式。另一种抗原弥散的方式就是,由于组织没有及时的固定所引起的。离体的组织不及时固定,组织就会自溶,抗原就会扩散,这是一非常普通的常识,但要做好却是极不容易。标本从外科切除到浸入固定液需要经过一段时间,在这段时间里,有的抗原就可以发生扩散。虽然已浸入了固定液,但标本较大,固定液的量又不足,当然由于固定液的渗透需要时间,当渗入到组织之中时,中间的细胞已发生了变化,抗原也随着发生扩散,这种现象在产酶多的器官是比较明显的,如胃癌,当切除后标本较大,虽然在手术室期间已放入了固定液,但固定液要透过肌层达到胃粘膜面起码需要几个小时的时间,当固定液发挥作用时,组织已经发生变化。因此,这了达到免疫组织化学染色的要求,对于离体的组织尽量快的进行固定,有条件的应将其剖开,早取材,早固定。

  二、组织脱水必须彻底干净

  组织块取材不能太大过厚,才能较好地完成脱水的过程。如果取材太厚,在较短的时间内脱水不完全,将可引起一系列的问题,比如浸蜡不彻底,切片不好完成,切不完整。由于先天不足,导致后来切片染色的脱落,造成染色的失败,或者由此反复操作,造成年人力物力的浪费,造成病理报告的延期发出等。因此,对取材的要求是除了要求要有艺术性外,即平整、外观好看,还要求适中。

  三、切片必须完整、均匀、平展、无邹折

  应用于免疫组织化学染色的切片,对切片的质量要求较高,切片必须完整,平展、无汽泡,无邹折,这样有利在染色时的冲洗,有利于切片的牢固附贴。如果切片不平展,免疫组化染色后,可出现染色不均匀的现象,颜色深浅不一, 不平。如果切片有汽泡切片在烘烤时,由于汽泡的破裂影响了汽泡周围的组织,在其周围可观察到深浅不一的染色。如果切片有邹折,免疫组化染色后,在邹折的地方有深浅不一的颜色,这是一种假阳性,容易引走混淆。

  四、切片的附贴必须牢固,必须使用合适的粘贴剂。

  免疫组织化学染色前的前期准备工作,就是必须对新的载玻片进行处理,新的载玻片表面看起来很干净,有人认为不需要进行任何的处理,都能够适合使用,这是一种错误的想法。新出厂的载玻片,表面复盖着开一层油脂样的物质,如果不加以处理,对切片的附贴是极为不利的。我们的做法是:新的载玻片,放于玻璃清洗液中浸泡4小时甚至过夜,然后取出,经自来水彻底冲洗后,浸入酒精中达2小时以上,取出擦干备用或烘干也可。然后再将载玻片浸入了-氨基-三乙氧基-硅烷(3-Aminopropyl triethoxy-silane)的稀释液(1:50用丙酮或无水乙醇稀释都可以)中硅化10分钟,后经无水乙醇洗2次,烘干即可使用。

  五、切片必须烘烤附贴牢固,既要经得起抗原修复时高温的作用而不使轻易脱片,又不至于破坏抗原。

  应用于免疫组化染色的切片。由于整个过程需经几个阶段的处理,如抗原修复时抗原修复液的沸腾且需持续十几分钟,PBS的反复冲洗,有的甚至于4℃冰箱中孵育达十几小时。因此,对切片的质量要求很高,尤其是切片的附贴程度。以往有人主张切片在60℃以下烘烤30-60分钟即可按此进行结果是切片掉片严重,切片松动率占100%。切片究竟烘烤多长时间才合适,既不脱片和适合各项要求,又不至于破坏抗原。几组实验[]诊断P173认为,切片在60℃的恒温干燥箱中烘烤2-5小时最为合适。这是因为:抗原可耐受如此的温度,病理科一般使用的石蜡,其熔点在60℃左右,组织浸蜡时,浸蜡箱中的温度,一般都调在65℃左右,组织在这样温度中要浸泡2小时以上,才能达到彻底地浸蜡。组织中的抗原已经受了65℃的温度考验,保存下来的抗原,都已具有耐热性。另外,经上述时间烘烤出来的切片,附贴牢固,抗原保存好,染色成功率达100%,保证了病理诊断的及时性和准确性。

  特需要注意的是,不管是应用于诊断的切片还是研究用的切片,烘烤后应尽快进行染色。如果切片切完后,迟迟不进行染色,存放于室温中或工作冰箱中,切片中的抗原将会随着时间的延长而逐渐消失,甚至出现假阴性。原则上是新鲜切片,即行染色,染多少张切多少张,这样才能尽可能的保存表达更多的抗原。

  六、切片脱蜡必须干净,否则将会影响免疫组化染色的最后结果。

  蜡不溶于水,不与其它的临床使用的抗体相融合。它只能靠特用的试剂,处理足够的时间,才能将其除去。如果脱蜡不干净,少许蜡存留于切片上,将会引起许多弊病,如染色不均匀,阳性物时隐时现,真假难辨,背景染色增加等。为了解决上述的问题,切片在染色前必须彻底脱蜡,目前用于脱蜡的试剂主要是二甲苯,因它脱蜡力强,脱蜡时间较短。较受使用者的青睐。脱蜡的时间要根据季节,室温和试剂的新鲜谋面是在不同。如果在夏天,室温较高,脱蜡试剂也新鲜,则脱蜡时间不需很多,3-5分钟就已足够。如果在冬天,室温较低,脱蜡试剂也较陈旧,则脱蜡时间需要延长,10-20分钟或更长。总之,操作时应根据不同的季节,不同的室温,不同的试剂来决定,脱蜡的时间,原则上是要彻底,干净,完全地脱去切片上的蜡。为了做到这一步,切片在脱蜡前的加温将有助于完成上述的要求。比如:当天切的切片,烧烤2小时后进行染色,切片带有温度进行脱蜡这将可加速脱蜡的过程,如果预先切好烤好的切片,在染色前,还必须对切片进行加温10-20分钟,然后再行脱蜡,这样脱蜡速度加快,效果魁伟更好。

  七、必须彻底抑制内源性过氧化物酶的活性,才能降低背景的染色。

  在各种组织中都含有很多的内源性过氧化物酶,尤其在红细胞,中性粒细胞,单核细胞嗜酸性细胞,出血的组织坏死的组织等等。含有这种酶的各细胞和组织如果在染色前不对其进行处理和抑制,它们将会在DAB底物的显色时,与HRP一样催化底样,使之显色,使之生成与阳性物一样的黄棕色,造成混乱。为止,在免疫组化染色前,都必须对内源性过氧化物酶进行抑制。当然,对它们进行彻底的消除是不行的,因为抑制太厉害,对抗原也会有相同的抑制作用。氢在抑制内源性过氧化物酶时,也要注意对抗原的保护抑制也只能对它们中的大部分在DAB显色后,显示出淡黄*色,这就足以与真正阳性物的区别。抑制剂常用的是0.3%的H2O2,也可将其称为1%H2O2,因为市售的H2O2的浓度为30%,按其净含量则为0.3%,如果按其溶液的用量则为1%。

  关于H2O2的使用,有的使用是单纯的H2O2稀释溶,有的使用是H2O2甲醇混合 物。根据实验,认为H2O2甲醇较适合于大多数的情况,因为除了H2O2外,甲醇对各种酶,都有钝化的作用,因此H2O2甲醇的双重作用效果较好。陈尚平等认为在多数情况中,用甲醇H2O2已经获得令人满意的结果。

  八、须适当合理地使用封闭试剂

  为了减少背景产生的非特异性染色,在免疫组化染色的过程中,在加入一抗孵育前,常常加入非免疫动物血清,以减少背景的染色,陈尚季等认为:抗体是高度的电荷分子,可能与带有相应电荷的组织成分无特异性地结合(如胶原)。由于这种非特异性结合,将导致标记的部分局部化(轭合物)和胶原的假阳性染色。要用一种不相干的抗体居先处理,可能减少和标记的抗体无特异性结合。

  以往,血清的使用有很多,如:小牛血清,马血清,山羊血清,绵羊血清,兔血清,浓度也有很多种,如:1%.2%.或1:5、1:10、和1:20.

  必须选择合适的抗体以及对作适当的保存和配制。

  九、选择合适的抗体

  至今为止,应用于临床的常用抗体有几十种,在这当中又可分为两种类型。

  1.浓缩型抗体

  根据近几年来使用的情况认为,它有许多优点,但也有许多不足之处:

  ①可作为各种疾病检测的常备抗体。在各单位的常规活检诊断中,有常见的病例,也有罕见的病例,尤其是后者,有时很长时间才遇到一例,这就给抗体的应用和备用提出了更高的要求,如除了常用的抗体外,还需备用一些较为罕见病例的抗体。这样才能解决临床的诊断问题,如临时购买,则需较长的时间,这样就会延误诊断。实践证明:浓缩型抗体,可作为常备检测抗体。当购买抗体后,根据检测病例的数量,在无菌的条件下,将抗体分成小包装,然后用蜡膜封起来,于-30℃的低温冰箱中保存,临用时取出一支,用指温促其回升至室温,然后用PBS稀释即可使用,这种抗体可保存3年左右。

  ②成本低,价格较便宜。

  它与即用型的抗体相比较,价格要便宜好多,如以某公司2002年-2003年的CK为例,浓缩型的抗体0.1ml,价格260元,该抗体可稀释为5000ml,以每张切片所需抗体为50ul计,可标记100例,每例一抗体所需2.6元,而即用型抗体1.5ml,价格150元,可标记30例,每例一抗体需5元。

  ③需要稀释抗体,手续较为复杂。  对于新购入的浓缩型的抗体,使用时必须将稀释为工作液,才能使用,对于从未用过的抗体,还必须实验其实际的稀释度,因为各种抗体,厂家都做了相应的稀释度的实验,但这是大概的稀释度,要使抗体真正适合于本单位的稀释度,就必须对抗体的稀释度进行实验,如1:100.1:75.1:50.1:25等,如果结果在1:50上是最佳结果,这就是最佳的稀释点,如果在这范围内找不出最佳稀释点,则应继续实验直到找出最佳稀释点为止。

  ④需要配置各型号的微量加样器,以利于量取精确的抗体量。

  ⑤需要具备一定的英语水平,因为浓缩型的抗体多为进口试剂,其使用书都以英文为主,其中涉入抗体的来源,适应让稀释对什么组织或细胞可起反应等。

  2.即用型抗体。

  近几年来,免疫组化技术应用的推广,即用型抗体的应用越来越受到人们的欢迎,根据几年来的使用,认为它有许多优点和不足:

  ①使用方便。对于初学者来说,它是一种最好的抗体,不管什么样的病例和切片,只要有抗体,不需要自己摸索稀释度,拿起试剂瓶一滴即可,极不方便。

  ②对于不具备或基本不懂免疫组化技术的人,只要按照说明书的方法使用,也能获得理想的结果。

  ③不需要配置多种昂贵的微量加样器。现今的微量加样器,如为进口货,贵者多达两千多元。而即用型抗体无需再行稀释,即买即用,无需配备其余器械。

  ④特别适合于基层单位。基层单位,无需多大的投资,就能开展免疫组化的工作,这对于提高诊断的准确率,极有好处。

  ⑤价格较浓缩型抗体贵。

  ⑥即用型抗体不可作为常备贮存抗体。即用型抗体,一般有效期为一年。如果用量大的单位,对于3ml一个包装的抗体,一年需要用几支,这对抗体来说,不会造成浪费。但如果为较小的单位,一年中标记的病例较少,购买抗体时也尽量选小包装的抗体,如1.5ml。如果碰上罕见的病例,有时一年也标记不了几例,这样就应采用浓缩的了。即用型的抗体,有效期为一年,但真正购买到的抗体使用期就不可能为一年,因为抗体从生产商到销售商的手里,需要一定的时间,如果运气好的话,你购买到的抗体,是刚交到销售商的手里,那么,使用的时间可能长些,但如果在销售商的手中滞留了一段时间,抗体的有效使用期就可能不会太长,五个月、六个月或者三个月。如果在有效的时间内不能使用完。稍为超过一些时间还可以,如果时间过长,就应当丢弃,因为会影响标记的质量。有人抱怨,刚买的抗体标记很好,后来就渐渐不好了。这是因为随着时间的延长,抗体的活性会逐渐失去生物活性,导致了标记质量的下降。

  (2) 抗体的适应症。

  在众多的抗体中,按它们的实际使用范围,把它们分为两个类:

  1.适合于冰冻切片,涂片,细胞培养片。

  2.适合于石蜡切片,冰冻切片,涂片和细胞培养片。

  (3)选择合适的单克隆或多克隆抗体。

  抗体除了分为上述的两个类外,从其克隆的高度讲,也有单克隆和多克隆之分。

  1.单克隆抗体,在目前临床常用的抗体当中,大部分都是单克隆抗体。这要归功于生物技术的不断提高。在早些时候,应用于临床的抗体,大多数为多克隆抗体。

  2.多克隆抗体,在临床应用的抗体中,还有少部分的抗体为多克隆抗体。

  (4)抗体的加入。

  这看似很简单的问题,如果处理不好也可导致不同的结果,如果应用自动免疫组织化学染色仪,将程序输入即可,如为手工操作,就必须注意以下的问题:

  1.当PBS冲洗完毕后,在加入抗体,如一抗,二抗或三抗。必须将存留于切片上的多余的PBS摔干,但不能让切片干涸,切片干涸,往往可产生非特异性染色,切片上PBS存留过多,将会稀释加入的抗体,影响加入抗体的浓度,同时也将影响最后的结果,如假阴性等。

  2.加入的抗体以一滴为佳。

  当擦干组织块周边多余的PBS后,切片保持着一定的湿润度,此时加入另外的抗体为最佳时候,滴入抗体以一滴50ml为好,加入后,轻微地摇匀地覆盖于切片上,使最后的结果稳定均衡,不至于有的地方有反应,有的地方无反应。

  3.切片没擦好将会影响加入抗体的质量,切片没冲洗干净,没擦试好,当加入抗体后,它可缩于切片的一边,此时你为了使加入的抗体能够完全地覆盖整个切片,便会使劲地加入抗体,此时的结果是,抗体依然滑向一边,或者完全露出,这不光没达到目的,还浪费抗体,正确的做法就是彻底地用PBS冲洗,摔干切片擦干切片周边的PBS,再滴入一滴抗体轻轻摇匀即可。

  (5)选择合适的孵育时间。

  第一抗体的孵育时间,有较多的使用范围,应用于临床检测抗体的孵育时间。一般室温下孵育在30-60分钟,120分钟,对于研究性质的抗体孵育时间,也可按照上述的时间,但也有人提出于4℃冰箱中过夜孵育,根据我们的经验一般不主张于4℃冰箱中过夜,原因是:

  1.长时间的孵育可以使一些非特异性的物质沉淀下来,或者被吸附,造成背景的染色。

  2.目前销售的抗体,纯度较高,特异性较强,不需要长时间的孵育,也能够结合得很好 。

  3.长时间的孵育,较容易引起切片的脱落,造成染色的失败。

  4.长时间的孵育,不利于临床病理报告的发出。

  十、连接抗体的选用必须正确,否则可造成假阴性的现象。

  免疫组化染色方法较多,如ABC法,SP法和EV二步法等,如果使用的是SP法,或者ABC法,这时就必须要仔细地选择好连接抗体,第一抗体有单克和多克隆炎分,连接抗体则要根据选用的抗体来进行,例如:第一抗体选用的是单克隆鼠抗人**抗体,连接抗体也要选择相应的免抗鼠IgG,这样才能连接上(目前生产厂家已生产出混合型抗体,即既适合于单克隆抗体,也适合于多克隆抗体。使用者不用担心连接不上,随便使用都可,但如果没有订购混合型的试剂盒,就必须注意的型号,使之完全适合所选用的抗体。)孵育的时间可在10分钟,20分钟或者30分钟,一般在室温中进行,如果室温低于20℃以下,则可在37℃的孵育箱中进行。

  十一、复合物的使用及孵育时间的确定。

  各种方法有各自的复合物,如ABC法,复合物是卵白素和生物素结合的复合物,再带有HRP,SP法,(LsAB法)的复合物是链雪菌素蛋白复合物,再带有HRP,EV二步法的复合物则是二抗和三抗连接在一起的复合物,再带上HRP,除此之外,根据水解底物的不同,可产生不同的颜色,例如:带有HRP的酶,水解的底物一般为DAB产生黄棕色,带AP的酶,水解的底物一般为AEC产生红色。

  十二、PBS的冲洗

  免疫组化的染色过程,除了前面的处理和加入的抗体外,都在PBS的冲冲洗洗中度过,PBS冲洗的正确与否,也是导致最后结果的关键。

  1.单独冲洗,防止交叉反应造成污染。

  临床上每天检测的病例很多,所用的抗体种类及项目也多,如果在加入一抗孵育完后,将它们在一个缸内洗,这样就会造成交叉污染,影响最后的结果。正确的做法是单独地进行冲洗,冲洗的PBS为一次性,保证切片没有相互交叉污染的机会。

  2.温柔冲洗,防止切片的脱落。

  冲洗切片,取出切片,将PBS从上轻轻地冲洗,让PBS自上而下流下来,不要拿起切片将PBS对准切片冲洗,这样由于冲出的PBS有一定的冲击力,很容易使切片周边引起松动,导致切片的脱落。

  3.冲洗的时间要足够,才能彻底洗去结合的物质。

  冲洗切片有人提出用微振荡器振染,振下未结合的各种物,使之不产生背景,此种做法一是浪费时间,二是很容易导致切片的脱落。切片的冲洗据实践认为,用一小烧杯柔和地于切片上冲洗,就能彻底冲洗去未结合的物质,无需附加其它条件,冲洗好于切片上再注入PBS,持续2分钟左右就完全足够了。

  4.PBS的PH和离子强度的使用和要求。

  刘彦仿指出:中性及弱硷性条件(PH7-8)有利于免疫复合物的形成,而酸性条件则有利于分解;低离子强度有利于免疫复合物的形成,而高离子强度则有利于分解。[]免疫组化P56我们目前常用的PBS的PH在7.4-7.6浓度是0.01M,根据本室十几年来的使用情况,认为该溶液价格便宜配制方面,使用效果好。

  5.常用试剂的配制和使用。

  在免疫组织化学的染色过程中,用得最多的试剂就是缓冲液,因为切片在整个染色中,抗体的加,换,切片的冲洗,DAB的配制都离不开缓冲液。可见缓冲液在整个染色中都起至关键的作用,缓冲液的过酸或偏碱,都将影响染色的结果。下面将介绍有关方面的内容:

  (1)缓冲液的配制

  1.磷酸盐缓冲液(Phosphate buffer solution.PBS)

  Ⅰ液:0.2M Na H2PO4贮存液(PH7.6)

  取一个具500ml的容量瓶,称量15.60g NaH2PO4﹒12H2O倒入瓶中,加入少量蒸馏水使劲摇晃,直至溶解,加入蒸馏水凑足500ml。放于4 冰箱保存,配制时应注意的事项:

  ①在配制时,要先确定NaH2PO4的用量,因为该试剂有许多种类形,它们所含的水分子量不一样,因而它们的用量也不一样。如NaH2PO4含单个水分子时,配制时要称取13.80g,而当含有2个水分子时,则需要称取15.60g。

  ②配制时根据要求选取蒸馏水。因为蒸馏水有数种,单蒸馏水,双蒸馏水,玻璃蒸馏水,去离子水。如没特别要求,选用一般的蒸馏水配制则可。

  ③装缓冲液的瓶子须用玻璃浸洗液泡洗过,以防污染,导致溶液中有雪菌生长。

  Ⅱ液:0.2M NaHPO4贮存液(HP7.6)

  取500ml的容量瓶,称好17.91g NaHPO4﹒12H2O,倒入瓶中,边加水边搅拌,直至完全溶解再凑足500ml,贮存于4℃冰箱。

  注意事项:

  ①该试剂也应注意有多种不同的含水分子量。

  ②该贮存液久放后可出现结晶。每次使用前,先取出回至室温,摇晃其结晶溶解,也可用微波炉促其快速溶解,然后再用。

  0.01M PBS工作液的配制:

  取一2000ml的容量瓶一个,装入已称好的NaCt18g,加入少量蒸馏水让其彻底溶解,再加入 Ⅰ液13ml,Ⅱ液87ml,加蒸馏水凑足2000ml,即可使用,即可使用该溶液在室温下可保存3-4周,但以新配为佳。

  PBS工作液配制完毕后,都要测其PH值,如果偏酸,可用氢氧化钠来调试,如果偏碱可用HCl调试,测试有如下n种方法:

  ①PH测试笔测试,这是一种简便、易行、结果较为准确的测试方法。当配制完PBS后,取一小杯,倒入配好的PBS,插入测试笔,打开开关,小屏幕上将可出现测出的PH结果。PH如果7.6不足,小量的可用0.2M Na2HPO4调校,大量的可用氢氧化钠调校。PH如果高于7.6,小量的用0.2M NaH2PO4调校,大量的可用HCL来调校。

  ②用试纸来测试:PH试纸有两种,一种为广泛PH试纸,范围在1-14,另一种是精密试纸有各种各样的范围。但是,作为冲洗切片用的PBS,其精确度不需要十分精确,如配PH7.6时,测试时在PH7.5或7.7,都可使用。试纸测试PH值,停靠其反应的颜色来确定,十分简便,一般的试剂都可用它来测试。

  ③仪器测试:对于要求较高,需较准确的PH值,须彩用仪器测试。

  1.Tris缓冲溶液(Tris buffer solution,TBS)

  ①1N HCL ,浓HCL(双重1.19)8.3ml,先取50ml蒸馏水,加入HCL再加水到100ml。

  ②0.5M Tris-HCL缓冲液(PH7.6)

  取Tris(羟甲基氨基甲烷)6.57g,加入少许的蒸馏水搅拌,直至溶解,再加入1N HCL42ml,然后用蒸馏水凑足100ml,于4℃冰箱保存。

  临用时,将上述溶液10稀释倍,即为0.05M工作液。

  注意事项:

  ①配制1N HCL时,如果大量配制,HCL入水时可产生很大的热量,对的所用的玻璃器皿应特别小心,以防突然产热而使玻璃器皿爆裂。

  ②调校PH值时,可参考上述的三种方法

来源:上海卡迈舒实验室科研试剂中国教育装备采购网作者:上海卡迈舒实验室科研试剂采购网

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