荧光定量PCR常见问题解答

中国教育装备采购网2014-12-02 09:20围观937次我要分享

  第一部分 核酸DNA和RNA提取常见问题分析1. RNAfixer的工作原理?浸入组织,抑制RNase的活性。运输方便,是非液氮类的一种样品储存液。2. 对于内源RNase丰富的组织和样品,如何消除RNase?可以在提取时候多加裂解液,比如4:1等。3. TRIpure and RNApure区别?胍盐类的裂解液一样,RNApure附加有离心柱,和漂洗液,是Kit。TRIpure只是裂解液。4. 凝血的gDNA和RNA的提取与新鲜血的提取不同?需加一个分离柱(separate column)分开凝血。5. microRNA提取和定量?过2次离心柱,得到200bp一下的小RNA。可以测定OD定量。6. 血清,血浆,血液RNA提取的区别?以及Viral RNA提取的方法?液体类样品RNA提取用TRIpure LS。一般血清、血浆是无细胞样品,含游离的RNA,量比较少,建议加Carrier RNA在提取时候。病毒RNA提取最好加Carrier RNA在提取时候,BioTeke有专门的病毒RNA提取试剂盒。7. 通用植物RNA提取常见问题:蛋白质污染?DNA污染-DNaseI消化(Kit does not provide it, please get it from other companies.)8. 真菌RNA提取可用RNApure 或者通用植物RNA提取Kit。9. DNA cleanup from gel and PCR, 区别?胶回收含有一个溶胶液。多功能胶回收可以用于胶回收和PCR产物回收。10. 土壤DNA提取优点?无需要机械破碎样品和过柱的纯化方式,减少DNA的锻炼和得率,达到实验目的。

  第二部分PCR/RT-PCR常见问题解答1. 二次PCR无目标产物,电泳孔道亮?Template稀释和重新设计引物2. microRNA的反转录问题?microRNA反转录和普通的mRNA的反转录不一样。现在常见的microRNA反转录引物有2种,一个是step-loop结构;另外一种是3末端加polyA后,再用oligo(dT)逆转录。BioTeke有microRNA提取和2-step real-time PCR Kit。3. cDNA的合成(RT)电泳,以及cDNA第二链的合成问题?2-5uLcDNA产物电泳有模糊条带出现。第二链合成也有专门的试剂盒。BioTeke现在没有此类产品。4. Power Mix扩增不成功因素?产品或者引物或者目的基因的不表达。5. RT-PCR没有扩增产物?可能是引物,模版,产品等。

  第三部分Real-time qPCR 常见问题分析1. 做标准曲线时候,可否用2个不同体系浓度的稀释分别对于内参和目的基因?建议最好用同样稀释倍数做曲线,因为模板浓度会影响扩增效率。2. 熔解曲线中,Tm不出现在80度左右?扩增片段100bp左右的,一般应该出现在80度左右。如果低于此温度出现,可能是模板降解。3. 扩增曲线没有Ct值,仅仅一条斜线?什么原因?模板浓度过低或者模板降解。4. 如果内参和目标基因表达量差别比较大,也就是目的基因的表达量少, Ctcon=15,Cttarget=38,可否应用?可以用于数据分析。因为表达量低,从而用过高模板进行扩增,从而同内标的模板不同,反而会增大数据统计的误差。5. 引物浓度可否是50nM,是否太低?如果扩增曲线和熔解曲线比较好,这个浓度当然可以。如果更低,扩增结果好的情况下,同样可以运用。一句话,所有的模板、引物等浓度尽量不要用高的,会影响扩增效率。6. miRNA多个扩增时候,如果一个的扩增效果比较,其它熔解曲线不止一个峰,如何解决?Primer对于miRNA是专一的。所以重新设计引物是不可取的。那么只能是提高Tm或者更换mastermix等。反应体系会影响反应产物的。7. 相对定量方法,如果用Ct值比较,是各个样品平均后在2delt Ct还是分别2 delt Ct在平均比较好?相对定量的方法各有优缺点,主要取决于实验的目的和材料的准备。如果是材料群体个体差异不大,这2种方法基本没有很大的区别;如果是个体差异比较大,建议用双标准曲线做。就是分别做内参和目的基因的标准曲线,分别带入Ct值计算。8. 熔解程序可否不加?如果是扩增效果好,特异扩增,可以不加熔解程序;但建议做好加上。9. 扩增反应体系5uL,扩增效率低,什么原因?反应体系小,各种因素的影响比较大,比如引物浓度、模板浓度及其金属离子等会影响扩增效率的。10. 如何减少非特异性扩增的干扰?设计一对好引物,提高primer的退火温度,以及设定吸光温度。

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