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  • 质粒的提取 碱法

    中国教育装备采购网2014-12-08 11:27围观1008次我要分享我要投稿

      实验目的

      了解碱法提取质粒的原理;

      掌握碱法提取质粒的方法。

      实验原理

      质粒是一种细菌染色体外的、具有自主复制能力的、共价闭合环状超螺旋结构的小型DNA分子。碱裂解法提取质粒是实验室常用的方法。

      这种方法是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。

      结构的三大要素:

      多克隆位点

      选择标记(耐药性,LacZ)

      独立的复制单位

      种类:

      质粒

      噬菌体

      酵母人工染色体(YAC)

      反转录病毒载体

      表达载体等

      pBC SK

      点击后可以查看更为清晰的原图

      T-载体

      在碱性条件(pH 12.5)下,线性染色体DNA的双螺旋结构解开而变性,质粒DNA的氢键虽然断裂但两条互补链彼此缠绕,紧密结合在一起。当加入乙酸钾恢复至中性时,染色体DNA分子难以复性,而质粒DNA分子很快复性,离心时染色体DNA与细胞碎片一起被沉淀出来,而质粒DNA则留在上清液中。

      用异丙醇或乙醇沉淀后洗涤,可得到较纯的质粒DNA。

      实验仪器、材料与试剂

      (一) 仪器

      1. 恒温摇床

      2. 超净工作台

      3. 高压灭菌

      4. 高速台式离心机

      5. 微量取液器

      (二) 材料

      含pBC KS质粒的大肠杆菌 DH 5α。

      含重组质粒的大肠杆菌 DH 5α。

      (三) 试剂

      1. LB液体培养基(1L)

      胰蛋白胨 10g

      酵母提取物 5 g

      NaCl 10 g

      加去离子水至800ml 搅拌,使溶质完全溶解,用NaOH调节pH值至7.0,加入去 离子水至总体积为1升,高压蒸汽灭菌20 分钟。

      LB固体培养基(1L)

      在上述LB液体培养基(1L)中加入琼脂粉15g。

      2. SolutionⅠ

      50 mmol/L 葡萄糖

      25 mmol/L Tris.?Cl (pH 8.0)

      10 mmol/L EDTA (pH 8.0)

      高压灭菌后,4℃保存备用。

      3. SolutionⅡ(现用现配制)

      0.2 mol/L NaOH

      1% SDS

      4. Solution Ⅲ(100 ml)

      5mol/L KAc 60 ml

      冰醋酸 11.5 ml

      水 28.5 ml

      配制成的溶液Ⅲ含3 mol/L钾盐、5 mol/L醋酸 (pH 4.8)。

      5. 氨苄青霉素(Amp)

      用无菌水配制成100 mg/ml 溶液,置-20℃冰箱保存备用。

      6. 胰RNA酶

      将胰RNA酶(RNA 酶 A)溶于10 mmol/L Tris.Cl (pH 7.5)、15 mmol/L NaCl中, 配成10 mg/ml的浓度,于100℃加热15分钟,缓慢冷却至室温,分装成小份保存于-20℃。

      7. 氯仿,乙醇 ,70%乙醇。

      实验步骤

      质粒的提取

      1. 用灭菌的牙签挑取单菌落放入50ml LB液体培养基(含Amp 0.1 mg/ml )中,37℃振荡培养过夜。

      2. 将菌液倒入1.5 ml Eppendorf管中,10,000 rpm离心1min,去掉上清液,重复两次。沉淀悬于200μL SolutionI 中, 涡旋使充分悬浮。

      3. 加入300μL SolutionII,混匀(注意动作轻),冰箱3 ℃放置5min。

      4. 加入300μL SolutionIII,混匀(注意动作轻) ,冰箱3 ℃放置5min。

      5. 12,000rpm,离心5min,将上清移至1个新Eppendorf 管中,注意所取体积(约600 μL ) 。

      6. 加入等体积氯仿(约600 μL ),混匀(注意动作轻)。12,000rpm,4℃,离心10min,取上清液。

      7. 上清液中加入预冷的等体积异丙醇,-20℃沉淀 20~30 min。

      8. 12,000 rpm离心15 min。

      9. 去上清,沉淀加入500μL 70%乙醇洗涤2次( 12,000 rpm离心3分钟)。

      10. 去掉上清(注意沉淀勿丢失),室温或真空干燥沉淀。

      11. 每管中加入25μL无菌水1μL RNase, 37℃溶解质粒DNA。

      Biospin 质粒DNA 小量提取试剂盒(实际用)

      操作过程

      1. 将1~1.5ml 过夜培养的细菌菌液加入1.5ml 离心管中。

      2. 于10,000rpm离心30 秒,并弃去上清液。

      如有需要,可多次重复步骤1、2,以收集更多细菌菌体。但勿过量,以免影响提取质粒的质量。

      3. 加250μl Resuspension Buffer,重悬细菌体沉淀。

      重悬后应该没有细菌团块。

      4. 加250μl 细胞Lysis Buffer,轻柔颠倒4~6 次。

      不要剧烈振动,以防止基因组DNA 被剪切。注意不要让反应持续超过5 分钟。

      5. 加350μl Neutralization Buffer,立即轻柔颠倒离心管4~6 次。

      溶液应该出现絮状物,但不会出现局部沉淀。

      6. 于13,000rpm离心10 分钟。

      如离心机转速不够可延长离心时间,直至形成紧密的白色沉淀。

      7. 将步骤6 离心后得到的上清液转移到Spin column 内。于6,000rpm离心1 分钟,并弃去接液管内液体。

      8. 向Spin column 内加650μl Wash Buffer,于12,000g 离心30~60 秒,并弃去接液管内液体。

      9. 重复第8 步一次。

      10. 再次于12,000rpm 离心1 分钟,然后将Spin column 转移到无菌的1.5ml 离心管中。如不进行该步离心,则无法保证离心柱内残液被彻底清除。

      11. 向Spin column 内加20μl Elution Buffer、去离子水或TE 溶液,并于室温静置1 分钟。

      可根据实验的实际需要决定洗脱液用量。

      12. 于12,000rpm离心1 分钟,1.5ml 离心管内溶液中含有质粒DNA。

      13. 提取的质粒DNA 可直接用于各类下游分子生物学实验,如果不立即使用,请保存于-20℃。

      实验结果及讨论

      碱法提取质粒是实验室最常用的质粒提取方法之一,提取量较大,便于操作。

      如有蛋白质残留,干燥后不透明,而呈白色。

    来源:上海创赛科学仪器有限公司作者:上海创赛科技有限公司我要投稿
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