原代细胞培养之培养技术

中国教育装备采购网2014-12-12 15:48围观946次我要分享

  原代细胞的培养方法

  原代细胞的培养也叫初代培养 是从供体取得组织细胞在体外进行的首次培养,是建立细胞系的第一步,是一项基本技术。原代细胞因刚从组织中分离开,生物学特性未发生很大变化,仍保留原来的遗传特性,也最接近和反映体内生长特性,适宜用于药物敏感性试验、细胞分化等实验研究。

  原代细胞往往有多种细胞组成,比较混杂,即使从形态上为同一类型(上皮样或成纤维样),但细胞间仍有很大差异。如果供体不同,即使组织类型、部位相同,个体差异也照样存在,原代细胞生物特性尚不稳定,如需做较为严格的对比性实验研究,还需进行短期传代培养。

  1、组织块培养法

  组织块培养是常用、简便易行和成功率较高的原代培养方法,也是早期采用培养细胞的方法,故原先被称为组织培养。其方法:为将剪成的小组织团块接种于培养瓶(或皿)中,瓶壁可预先涂以胶原薄层,以利于组织块粘着于瓶壁,使周边细胞能沿瓶壁向外生长,方法简便,利于培养,部分种类的组织细胞在小块贴壁24小时后细胞就从组织块四周游出,然后逐渐延伸,长成肉眼可以观察到的生长晕,5~7天后组织块中央的组织细胞逐渐坏死脱落和发生漂浮,此漂浮小块可随换液而弃去,由组织块周围延伸的贴壁细胞也逐渐形成层片,可在显微镜下观察形态和用于实验研究。其培养方法如下:

  (1)按照前述方法取材,将组织剪成或切成1mm3大小的小块,并加入少许培养基使组织湿润。

  (2)将小块均匀涂布于瓶壁,每小块间距0.2 cm~0.5cm,一般在25mL培养瓶(底面积为17.5cm2)可接种20~30小块为宜,小块放置后,轻轻翻转培养瓶,使瓶底朝上,然后于瓶内加入适量培养基盖好瓶塞,将瓶倾斜放置在37℃温箱内。

  (3)培养2~4小时,待小块贴附后,将培养瓶缓慢翻转平放,静置培养,动作要轻,严禁摇动和来回振荡,以防由于冲动而使小块漂起而造成培养失败,若组织块不易贴壁可预先在瓶壁涂一薄层血清、胎汁或鼠尾胶原等。开始培养时培养基不宜多,以保持组织块湿润即可,培养24小时后再补液,培养初期移动和观察时要轻拿轻放,开始几天尽量不去搬动,以利贴壁和生长,培养3~5天时可换液,一方面补充营养,一方面去除代谢产物和漂浮小块所产生的毒性作用。

  原代细胞培养-2

  2.消化培养法

  该方法是采用前述的消化分散法,将妨碍细胞生长的细胞间质(包括基质、纤维等)去除,使细胞分散形成细胞悬液,然后分瓶培养。

  某些特殊类型细胞,如内皮细胞、骨细胞等的消化手段和步骤,将在有关章节中叙述。

  3.悬浮细胞培养法

  对于悬浮生长的细胞,如白血病细胞、淋巴细胞、骨髓细胞、胸水和腹水中的癌细胞和免疫细胞无需消化,可采用低速离心分离,直接培养,或经淋巴细胞分层液分离后接种培养。

  4.器官培养

  器官培养是指从供体取得器官或组织块后,不进行组织分离而直接在体外的特定环境条件下培养,其特性仍保持原有器官细胞的组织结构和联系、并能存活,器官培养的目的和技术均与单层细胞培养不同,但可利用器官培养对器官组织的生长变化进行体外观察。并观察不同培养条件研究对器官组织的影响。器官培养可保持器官组织的相对完整性,可用于重点观察细胞间的联系、排列情况和相互影响,以及局部环境的生物调节作用。体外器官培养为临床上的器官移植创造了便利的条件。器官培养的条件与细胞培养不同,要有特殊的要求。

  1. 器官培养的特殊的要求

  (1)需要特殊的培养条件 因器官离体培养,其营养和氧气仅靠自然渗透来供给,因此,培养时为了确保中心不发生缺乏氧和营养而造成坏死,其厚度或直径不宜超过1mm。

  (2)器官内部细胞需要有足够的氧气渗入 常采用以下两种方法:

  ① 将器官组织块置于培养基气液面以利于气体交换。

  提高培养基中的氧分压,一般需加注纯氧,提高氧分压时仍需保持5% CO2,以维持pH。

  2. 器官培养的方法

  (1)将不锈钢网做成的支架,放置于培养皿中,高度为1/2皿高,使其表面铺上0.5mm孔径的滤膜。

  (2)将培养基加入平皿中,使培养液刚刚接触到滤膜,但不要使滤膜浮起。

  (3)将要培养的器官组织平放在滤膜上,一般厚度不要超过200μm,水平面积不超过10mm2,如为肝、肾不能大于1mm2。

  (4)将培养物置于CO2培养箱内,并加注氧气,调整氧分压达90%,培养时注意使液面与膜保持在一致的水平上。

  (5)上述器官培养1~3周(每隔2~3天换液一次)后可用于实验和检测。

  原代细胞的培养与维持

  (一)原代细胞培养

  1、静置贴壁细胞(包括半贴壁细胞的培养)

  凡经消化液处理实体组织来源的细胞要通过充分漂洗,以尽量除去消化液的毒性,细胞接种时浓度要稍大一些,至少为5×108细胞/L,培养基可用Eagle(MEM)或DNEM培养,小牛血清浓度为10%~80%,有条件的应在37℃ 5% CO2的培养箱中培养,在起始的2天中尽量减少振荡,以防止刚贴壁的细胞发生脱落,漂浮。若原代贴壁细胞不是用于长期培养,只是用于分离繁殖或测定病毒之用,其细胞浓度可以加大,尽量贴成厚层以利病毒的效价提高和测定结果(如空斑)更加明显、准确,待细胞基本贴壁伸展并逐渐形成网状,此时的pH若有明显变化,应将原代细胞换液,即倒去旧液,换入新鲜的培养基,以便除去衰老、死亡的细胞和陈旧的培养基,使贴壁细胞能获得充足的营养。

  若用骨髓或外周血中的悬浮细胞经静置培养1周时,可有少量的肌样纤维间质细胞或基质细胞开始贴壁生长,为了利于该贴壁细胞充分贴壁和生长,此时换液应将细胞悬液经低速离心后,按半量换液方式弃去旧液加入新液,然后再将细胞悬液放入原瓶中继续培养,经反复几次换液后,贴壁肌样细胞逐渐形成网状,此时换液可将原悬浮细胞和培养基移入另一新瓶,然后分别补加新鲜培养基(也按半量换液方式分别对半加入新液)继续培养,原瓶的贴壁细胞逐渐长成单层,而新瓶中又会出现二次贴壁细胞,经几次换液也会逐渐长成单层,在此类细胞培养时,培养基中往往需加入少量的维生素D3、bFGF、地塞米松、小牛血清(浓度要在20%以上),以利细胞贴壁生长。

  2、悬浮细胞的培养

  凡来自外周血、胸腹水、脾脏、淋巴结、骨髓的淋巴细胞、造血干细胞以及白血病细胞,在原代培养时要尽量去除红细胞。若作用于试验的短期培养,可在含10%小牛血清的RPMI1640培养基中进行培养,细胞浓度可在5~8×109/L范围内,然后进行分瓶试验。若要将淋巴细胞及白血病细胞进行长期培养,淋巴细胞中要加入生长因子,白血病细胞中要加入少量的原患者血清,以利细胞生长,待细胞开始增殖甚至结成小团块,培养基中pH变酸,说明细胞生长繁殖良好,一般每隔3天需半量换液一次(换液时尽量使细胞不丢失),待细胞增殖加快,浓度明显增加,pH发生明显变化时,此时可考虑传代。但千万不能急于传代,一定要待细胞密度较高时才能进行,以防传代失败。

  (二)原代细胞的维持

  1、贴壁细胞(包括半贴壁细胞的换液)

  贴壁细胞长成网状或基本单层时,由于营养缺乏,代谢产物增多,pH变酸,不适宜细胞生长,此时细胞还未长成单层,未达到饱和密度,仍需继续培养,因此,需采取换液方式来更新营养成分以满足细胞继续生长繁殖的需要。其换液方法比较简单,即弃去旧液,加入与原培养液相同的等量完全培养基。若希望细胞能在较长时间内能维持存活,但不需增殖,此时要换成含2%小牛血清的维持液。

  2、悬浮细胞

  凡经培养后只在细胞培养基中悬浮生长而不贴壁的细胞,需在倒置显微镜下方可观察到细胞的形态和生长现象,淋巴细胞的短期培养无需换液,但加入生长因子或有丝分裂源(PHA、PMA、COnA、PWM、LPS等)后,细胞不仅会发生转化而且会发生分裂繁殖,此时培养基中的营养成分并不能维持细胞的营养需求,加之代谢产物增多,pH变酸,细胞不适宜生长,需进行换液。白血病细胞或淋巴瘤细胞体外长期培养时,都需换液培养,待达到饱和密度时才能传代。换液时,只能采用半量换液的方式,千万不能采取倒去旧液加入新液的方式进行换液。半量换液的方法如下:

  将原培养瓶竖起,在30分钟内,若细胞沉于瓶底,可用吸管轻轻吸去一半上清弃去,再加入等量的新鲜完全培养基。若细胞不能沉于瓶底,可吸出细胞悬液,采用低速离心(1000r/min 10min)弃去一半上清加入等量的新鲜完全培养基,混匀后再转入原瓶继续培养。

来源:卡迈舒(上海)生物科技有限公司作者:卡迈舒(上海)生物科技有限公司

相关阅读