荧光PCR的绝对和相对定量分析方法

中国教育装备采购网2014-12-24 09:49围观992次我要分享

  对荧光定量PCR结果的分析方法我们分为两种:绝对定量分析法和相对定量分析法。

  1、绝对定量分析方法,起始浓度的对数跟循环数的线性关系,标准曲线由已知拷贝数的标准品绘制,根据样品的Ct值,可求样品的模板量。

  (1)标准品的制备:

  1V的样品原液(i)+9V稀释缓冲液,得到ii;

  1V的ii +9V稀释缓冲液,得到iii;

  1V的iii + 9V稀释缓冲液,得到iv;

  1V的iv +9V稀释缓冲液,得到v。

  (2)拷贝数的计算:待测样本浓度(ng/ul)=OD260×40*稀释倍数

  样品分子量+碱基数×324

  待测样本拷贝数=待测样本浓度/样本分子量×6×1014

  从扩增数据得到循环数,通过标准曲线,我们可以求出样品的拷贝数。

  2.相对定量分析方法:

  其又可有双标准曲线法和双Ct法。所谓相对,就只是实验前后结果的对比,反映了反应前后的数据的差值。

  (1)双标准曲线法,分析简单,但是对于每一个基因,每一轮实验都需要做标准曲线,而且必须有特定的标准品作标准曲线,这样的标准品不代表样品扩增的真实状态。这种方法常用于基因表达调控。

  F=待测样品目的基因浓度/待测样品参照基因浓度÷对照样品目的基因浓度/对照样品参照基因浓度

  (2)双Ct法,此方法不用对看家基因和目的基因做标准曲线,而只需要对待测样品分别进行PCR扩增即可,标准曲线的差值<0.1.假若扩增效率为100%或标准曲线及每次扩增之间的效率都保持一致,这样实验条件优化较难为复杂。这种分析方法较长用于基因表达调控研究中。

荧光PCR的绝对和相对定量分析方法
来源:上海雅浦生物科技有限公司作者:上海雅浦生物科技有限公司

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