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  • 真核细胞DNA的制备与定量

    中国教育装备采购网2015-01-07 09:16围观979次我要分享我要投稿

      制备基因组DNA是进行基因结构和功能研究的重要步骤,通常要求得到的片段的长度不小于100-200kb。在DNA提取过程中应尽量避免使DNA断裂和降解的各种因素,以保证DNA的完整性,为后续的实验打下基础。一般真核细胞基因组DNA有107-9bp,可以从新鲜组织、培养细胞或低温保存的组织细胞中提取,常是采用在EDTA以及SDS等试剂存在下用蛋白酶K消化细胞,随后用酚抽提而实现的。这一方法获得的DNA不仅经酶切后可用于Southern分析,还可用于PCR的模板、文库构建等实验。

      根据材料来源不同,采取不同的材料处理方法,而后的DNA提取方法大体类似。

      但都应考虑以下两个原则:

      (1)防止和抑制DNase对DNA的降解;

      (2)尽量减少对溶液中DNA的机械剪切破坏。

      一、试剂准备

      1.TE: 10mM Tris-HCl (pH 7.8); 1mM EDTA (pH 8.0)。

      2.TBS: 25mM Tris-HCl (pH 7.4); 200mM NaCl; 5mM KCl。

      3.裂解缓冲液:250mM SDS; 使用前加入蛋白酶K至100mg/ml。

      4.20% SDS

      5.2mg/ml蛋白酶K

      6.Tris饱和酚(pH 8.0)、酚/氯仿(酚∶氯仿=1∶1)、氯仿

      7.无水乙醇、75%乙醇

      二、操作步骤

      (一)材料处理

      1.新鲜或冰冻组织处理:

      ⑴ 取组织块0.3-0.5cm3, 剪碎,加TE 0.5ml,转移到匀浆器中匀浆。

      ⑵ 将匀浆液转移到1.5ml离心管中。

      ⑶ 加20% SDS 25 ml,蛋白酶K (2mg/ml) 25 ml,混匀。

      ⑷ 60°C水浴1-3hr。

      2.培养细胞处理:

      ⑴ 将培养细胞悬浮后,用TBS洗涤一次。

      ⑵ 离心4000g×5min,去除上清液。

      ⑶ 加10倍体积的裂解缓冲液。

      ⑷ 50-55°C水浴1-2hr。

      (二)DNA提取

      1. 加等体积饱和酚至上述样品处理液中,温和、充分混匀3min。

      2. 离心5000g×10min,取上层水相到另一1.5ml离心管中。

      3. 加等体积饱和酚,混匀,离心5000g×10min,取上层水相到另一管中。

      4. 加等体积酚/氯仿,轻轻混匀,离心5000g×10min,取上层水相到另一管中。如水相仍不澄清,可重复此步骤数次。

      5. 加等体积氯仿,轻轻混匀,离心5000g×10min,取上层水相到另一管中。

      6. 加1/10体积的3M醋酸钠(pH 5.2)和2.5倍体积的无水乙醇,轻轻倒置混匀。

      7. 待絮状物出现后,离心5000g×5min,弃上清液。

      8. 沉淀用75%乙醇洗涤,离心5000g×3min ,弃上清液。

      9. 室温下挥发乙醇,待沉淀将近透明后加50-100ml TE溶解过夜。

      (三)DNA定量和电泳检测

      1.DNA定量:

      DNA在260nm处有最大的吸收峰,蛋白质在280nm处有最大的吸收峰,盐和小分子则集中在230nm处。因此,可以用260nm波长进行分光测定DNA浓度,OD值为1相当于大约50μg/ml双链DNA。如用1cm光径,用 H2O稀释DNA样品n倍并以H2O为空白对照,根据此时读出的OD260值即可计算出样品稀释前的浓度:DNA(mg/ml)=50×OD260读数×稀释倍数/1000。

      DNA纯品的OD260/OD280为1.8,故根据OD260/OD280的值可以估计DNA的纯度。若比值较高说明含有RNA,比值较低说明有残余蛋白质存在。OD230/OD260的比值应在0.4-0.5之间,若比值较高说明有残余的盐存在。

      2.电泳检测:

      取1μg基因组DNA用行0.8%琼脂糖凝胶上电泳,检测DNA的完整性,或多个样品的浓度是否相同。电泳结束后在点样孔附近应有单一的高分子量条带。

      三、注意事项

      1. 所有用品均需要高温高压,以灭活残余的DNA酶。

      2. 所有试剂均用高压灭菌双蒸水配制。

      3. 用大口滴管或吸头操作,以尽量减少打断DNA的可能性。

      4. 用上述方法提取的DNA纯度可以满足一般实验(如Southern 杂交、PCR等)目的。如要求更高,可进行DNA纯化。

      质粒DNA的碱裂解法提取与纯化

      细菌质粒是一类双链、闭环的DNA,大小范围从1kb至200kb以上不等。各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份,通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态,但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上,随着染色体的复制而复制,并通过细胞分裂传递到后代。

      质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子,重要的条件是可获得大量纯化的质粒DNA分子。目前已有许多方法可用于质粒DNA的提取,本实验采用碱裂解法提取质粒DNA。

      碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法,其基本原理为:当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时,蛋白质与DNA发生变性,当加入中和液后,质粒DNA分子能够迅速复性,呈溶解状态,离心时留在上清中;蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状,离心时可沉淀下来。

      纯化质粒DNA的方法通常是利用了质粒DNA相对较小及共价闭环两个性质。例如,氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心、离子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等方法,但这些方法相对昂贵或费时。对于小量制备的质粒DNA,经过苯酚、氯仿抽提,RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA,所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求,故在分子生物学实验室中常用。

    来源:上海创赛科学仪器有限公司作者:上海创赛科技有限公司我要投稿
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