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  • 在WB实验中为什么需要使用内参抗体

    中国教育装备采购网2015-09-07 15:47围观535次我要分享

      上海信帆代做WB实验,欢迎来电咨询。

      在WB实验中为什么需要使用内参抗体

      要检测一个基因的表达产物是否正确,或者比较表达产物量的相对变化,首选方法是Western Blot。虽然,顺利的时候Western Blot做起来很简单,可不顺的时候也很令人心烦――做不出结果啦、假阳性啦、结果出现多条带啦、到底是一抗有问题还是二抗有问题啦……毕竟,作为一种有活性的生物大分子,抗体和抗原的反应毕竟不象1+1那么明确,而用这种不确定的试剂来测定同样知之甚少的表达产物,确实是有一定的不确定性的。所以,严谨的Western Blot实验设计中要求有良好的参照体系,对实验结果分析是非常有用的。

      我们知道,要用Western Blot比较不同条件下或者不同组织中,目的蛋白表达量的相对多少,前提条件是等量的细胞上样,才有比较的基础。特别表达量不高时,上样量的差别就很可能影响结果的分析。艾美捷向您推荐使用内参抗体来检测您的实验系统,或者校准您的实验结果。内参即是内部参照(Internal Control),对于哺乳动物细胞表达来说一般是指由管家基因编码表达的蛋白(Housekeeping Protei),它们在各组织和细胞中的表达相对恒定,在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物。在Western Blotting中使用内参其实就是在WB过程中的另外用内参对应的抗体检测内参,这样在检测目的产物的同时可以检测内参的表达,由于内参在各组织和细胞中的表达相对恒定,借助检测每个样品内参的量就可以用于校正上样误差,这样半定量的结果才更为可信。此外使用内参可以作为空白对照,检测蛋白转膜情况是否完全、整个Western Blot显色或者发光体系是否正常。

      实验结果分析其实很简单:如果样品蛋白量有限,只够进行一次电泳转膜实验时,分别检测样品的内参量和目的蛋白量。将各样品目的蛋白量分别除以其内参含量,得到的数值即为内参校正后的各样品中目的蛋白相对含量,再用此数值进行样品间的比较和分析,得到目的蛋白含量在不同样品间的实际变化结果。如果样品量充分,可以先检测内参,观测样品间内参显色条带是否一致,根据差异大小调整各样品的上样量重新进行Western Blotting实验,至内参量一致为止;若内参一致,即可进行不同样品间目的蛋白表达变化分析。这样虽然麻烦一点,但是可以保证结果更有说服力,更可信。毕竟我们的实验是一种严谨的工作。

      常用的蛋白质内参有GAPDH(glyceraldehyde-3-phohate dehydrogenase)和细胞骨架蛋白beta-actin或beta-tubulin。最近的国外文献报道中使用GAPDH内参的较多。艾美捷公司向您推荐进口内参抗体产品,我们能提供小鼠源、兔源等多种来源的上述内参抗体,并且也能根据您的实验要求向您推荐不同的产品。与国产的内参抗体相比,同样是100ul,但是进口内参具有更高的稀释比率和效价,因此具有更好的性价比。

    来源:上海信帆生物科技有限公司作者:上海信帆生物科技有限公司
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