一、实验目的 1、学习克隆工作中最常用的双酶切; 2、学习将外源基因与质粒连接方法及操作技术; 3、学习氯化钙法制备大肠杆菌(Escherichia coli)感受态细胞的技术; 4、了解细胞转化的概念及其在分子生物学研究中的意义。 5、外源质粒DNA转入受体菌细胞的技术以及筛选转化体的技术。 6、学习鉴定重组子的方法。 二、 实验原理 重组子的建立：采用双酶切质粒载体pBR322和pUC18，酶切后产生了互补的粘性末端，在T4 DNA 连接酶的作用下，两个质粒片段连接。 感受态细胞(Competent cells)：受体细胞经过一些特殊方法(如：CaCl，RuCl等化学试剂法)的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许多有外源DNA的载体分子通过的感受态细胞(competent cell) 。
??? 转化(transformation)：是将异源DNA分子引入一细胞株系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段，是基因工程(Genetic Engineering)等研究领域的基本实验技术。 电转化法：使用低盐缓冲液或水洗制备的感受态细胞，通过高压脉冲的作用将载体DNA分子导入受体细胞。 克隆的筛选：主要用不同抗生素(antibiotic)基因筛选。常用的抗生素(antibiotic)有：氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素、四环素、链霉素等; 重组质粒克隆的鉴定：鉴定带有重组质粒克隆的方法常用的有α-互补、小规模制备质粒DNA进行酶切分析、插入失活、PCR以及杂交筛选的方法。最常用的方法是小规模制备质粒DNA进行酶切分析，对于带有LacZ基因的载体还可以结合α-互补现象来筛选。 三、试剂与器材 1、试剂 pUC18质粒，pBR322质粒，DL2000 Marker, Pst I(15U/ul)及酶切缓冲液, EcoR I(15U/ul)及酶切缓冲液，DNA Ligation Kit Ver 2.1 (TaKaRa)，LB液体培养基(Luria-Bertani) ，LB固体培养基，50mg/ml卡那霉素(kanamycin)储存液，质粒快速提取试剂盒(博大泰克)，10 X Buffer K， Pst I，EcoR I (TaKaRa) 2、器材 电基因转移议，恒温摇床，台式高速离心机，恒温水浴锅， 琼脂糖凝胶电泳装置，电热恒温培养箱，电泳仪，超净工作台， 微量移液枪，eppendorf管。 四、操作方法 1.构建重组质粒 质粒pUC18和pBR322分别用Pst I和EcoR I双酶切，将酶切产物按照1：1的比例混合，使用T4 DNA连接酶连接，构建成重组质粒。 2.制备感受态大肠杆菌(Escherichia coli)细胞 收集大肠杆菌(Escherichia coli)细胞，采用CaCl2 处理，制备成感受态细胞。 3.重组子的转化 将构建的重组质粒加入到制备的感受态细胞悬浮液中，电击法将重组质粒转化到宿主细胞中。 4.重组子的筛选鉴定 采用蓝白筛选重组子。酚/氯仿快速抽提质粒，酶切后电泳鉴定。 ?五、关键步骤与注意事项 2.连接反应温度选择要适中，过高粘末端之间形成氢键不稳定，过低会影响连接酶的活性。 3.连接反应两种质粒的比例为1：1，否则容易自连。 4.制备感受态细胞时要采用对数生长期初期的细胞，低温处理时间要足够。 5.电击法时电击电压、电流、时间选择要合适。 6.转化及蓝白筛选要作阴、阳性对照，防止出现假阳性、假阴性。
