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细菌DNA的提取方法

教育装备采购网 2016-08-11 09:37 围观747次

  DNA提取主要是CTAB方法,其他的方法还有物理方式如玻璃珠法、超声波法、研磨法、冻融法。化学方式如异硫氰酸胍法、碱裂解法。生物方式:酶法。根据核酸分离纯化方式的不同有;硅质材料、阴离子交换树脂等。

  方法(一)

  试剂:

  1. 抽提缓冲液、2% CTAB (W/V)、2% PVP K25 (w/v) (去色素)、100mM Tris-HCl (pH8.0)、25mM EDTA、(pH8.0)、2.0M NaCl。上海创赛提供乙二胺四乙酸(EDTA)标液,60-00-4,商品编号:D16-1014183-浓度:0.1N/L,价格288元。

  2.10M LiCl

  3. 2M LiCl

  4.DEPC-water(抑制RNA酶活性)

  5. 3M NaAc (pH5.2)

  6. 96% 乙醇

  7. 70% 乙醇

  步骤:

  1.抽提缓冲液65℃预热;

  2. 加菌体到已经预热的缓冲液(700ul)中混匀,65℃,10min;

  3. 加酚/氯仿/异戊醇(25:24:1),振荡,离心12,000rpm,10min;

  4.取上清,加氯仿/异戊醇(24:1)振荡,离心12,000rpm,10min;

  5. 取上清,重复4步骤;

  6. 加入1/10体积的3M醋酸钠和1.5倍体积的乙醇(或加入等体积的异丙醇),-20C沉淀;

  11. 离心12,000rpm,10min;

  12. 弃上清,70%乙醇洗,也可以再用100%乙醇洗,然后溶解于100ml 水中。

  方法(二)

  1. 将菌株接种于液体LB培养基,37℃震荡培养过夜。

  2. 取1.5ml培养物12000rpm离心2min。

  3. 沉淀物加入567 ul的TE缓冲液,反复吹打使之重新悬浮,加入30ul 10%SDS和15ul的蛋白酶K,混匀,于37℃温育1h。上海创赛提供十二烷基硫酸钠(SDS),AR,92.5-100.5%,151-21-3,商品编号:C16-S10436-500g,价格50元。

  4. 加入100ul 5mol/L NaCl, 充分混匀,再加入80ul CTAB/NaCl溶液,混匀后再65℃温育10min。

  5. 加入等体积的酚/氯仿/异戊醇混匀,离心4-5min, 将上清转入一只新管中,加入0.6-0.8倍体积的异丙醇,轻轻混合直到DNA沉淀下来,沉淀可稍加离心。上海创赛提供异丙醇,99.5%,超干,含分子筛,水≤50ppm,67-63-0,商品编号:C52-H11026-100ml,价格150元。

  6. 沉淀用1ml的70%乙醇洗涤后,离心弃乙醇。

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