真菌,是一种真核生物。最常见的真菌是各类蕈类,另外真菌也包括霉菌和酵母。现在已经发现了七万多种真菌,估计只是所有存在的一小半。大多真菌原先被分入动物或植物,现在成为自己的界,分为四门。真菌自成一门,和植物、动物和细菌相区别。真菌和其他三种生物最大的不同之处在于,真菌的细胞有含甲壳素(又叫几丁质、甲壳素、壳多糖)为主要成分的细胞壁,和植物的细胞壁主要是由纤维素组成的不同。
无性繁殖(asexual reproduction)是指营养体不经过核配和减数分裂产生后代个体的繁殖。它的基本特征是营养繁殖通常直接由菌丝分化产生无性孢子。
真菌并没有整条的性染色体,只有一些DNA片段起着相同的作用。真菌生长发育到一定时期(一般到后期)就进行有性生殖(sexualre production)。有性生殖是经过两个性细胞结合后细胞核产生减数分裂产生孢子的繁殖方式。多数真菌由菌丝分化产生性器官即配子囊(gametangium),通过雌、雄配子囊结合形成有性孢子。其整个过程可分为质配(plasmogamy)、核配(karyogamy)和减数分裂(meiosis)三个阶段。
真菌DNA的提取方法:
(一)
1.取真菌菌丝0.5g, 在液氮中迅速研磨成粉
2.加入4mL提取液,快速振荡混匀
3.加入等体积的4mL的氯仿:异戊醇(24:1),涡旋3~5min(此处是粗提没有加酚,可以节约成本的哟!)
4.1000rpm,4℃,5min,上海创赛提供异戊醇,3-Methyl-1-butanol ,GCS,≥99.8% (GC),123-51-3,商品编号:C16-M11211-5ml,价格85元。
5.上清用体积的氯仿:异戊醇(24:1)再抽提一次(10,000 rpm,4℃离心5 min)
6.取上清,加入2/3倍体积的-20℃预冷异丙醇或2.5倍体积的无水乙醇沉淀, 混匀, 静置约30 min
7.用毛细玻棒挑出絮状沉淀, 用75%乙醇反复漂洗数次, 再用无水乙醇漂洗1次, 吹干,重悬于500 ulTE中
8.加入1 ul RNaseA (10 mg/mL),37℃处理1 hr
9.用酚(pH8.0):氯仿:异戊醇(25:24:1)和氯仿:异戊醇(24:1)各抽提1次(10,000 rpm,4℃离心5 min)
10.取上清,1/10V 3M NaAc,2.5V体积的无水乙醇, -70℃沉淀30 min以上
11.沉淀用75%乙醇漂洗,风干, 溶于200 ulTE中,-20 ℃保存备用
DNA提取液:0.2M Tris-HCl(pH 7.5),0.5M NaCl,0.01M EDTA,1%SDS,3M NaAc,上海创赛提供三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐,>99.5 (滴定),1185-53-1,商品编号:B11000465-100g,价格94.5元。
(二)
1.真菌菌丝0.5-1 g, 在液氮中迅速研磨成粉
2.加入3 mL 65℃预热的DNA提取缓冲液,快速振荡混匀65℃水浴30 min, 期间混匀2-3次
3.加入1 mL 5M KAc,冰浴20 min
4.等体积的氯仿:异戊醇(24:1)抽提1次(10,000 rpm,4℃离心5 min),上海创赛提供氘代氯仿,99.8 atom%D[氘代试剂],865-49-6,商品编号:C52-H50480-100ml,价格290元。
5.取上清,加入2/3倍体积的-20℃预冷异丙醇, 混匀, 静置约30 min
6.用毛细玻棒挑出絮状沉淀, 用75%乙醇反复漂洗数次, 再用无水乙醇漂洗1次, 吹干,重悬于500 L TE中
7.加入1 ul RNaseA (10 mg/mL),37℃处理1 hr
8.用酚(pH8.0):氯仿:异戊醇(25:24:1)和氯仿:异戊醇(24:1)各抽提1次(10,000 rpm,4℃离心5 min)
9.取上清,1/10V 3M NaAc,2.5V体积的无水乙醇, -70℃沉淀30 min以上
10.沉淀用75%乙醇漂洗,风干, 溶于200 ul TE中,-20 ℃保存备用。
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