Feulgen染色是经典显示去氧核糖核酸的方法,DNA定量测定的主要染色方法之一。
反应原理
标本经稀盐酸水解后,DNA分子中的嘌呤碱基被解离,从而在核糖的一端出现了醛基。Schiff试剂中的无色品红可与醛基反应,形成含有醌基的化合物分子, 因醌基为发色团,故可呈现出紫红色。也就是说, DNA经稀酸水解后产生的醛基,具有还原作用,可与无色品红结合形成紫红色化合物,从而显示出DNA的分布。
反应方程式
2HCl Na2S2O5→2NaCl SO2 H2SO3
DNA是主要的遗传物质,集中于染色体上。1924年孚尔根首先用席夫试剂(Schiff)作试验,鉴定了染色体上DNA的存在,故称为孚尔根染色法。孚尔根染色法的反应原理主要与席夫试剂的化学性质有关,此试剂的基本成分是碱性品红,偏亚硫酸氢钠(NaHSO3)和盐酸.碱性品红的主要成分是三氨基三苯甲烷氯化物。上海创赛科技提供亚硫酸氢钠(AR),Sodium bisulfate,7631-90-5,商品编号:C84-2756-500G,价格76元。
碱性品红原为桃红色,当与亚硫酸作用时被氧化,使醌型变为苯型,由桃红色变为无色透明的N-亚磺酸亚硫酸副品红碱,当它与醛基作用时,其分子式又恢复为醌型结构,呈现紫红色。上海创赛科技提供碱性品红,AR,632-99-5,商品编号:D16-1009943-25g,价格29元。
利用1M HCl 、60℃下水解时,可将DNA分子中嘌呤碱基与去氧核糖之间的糖苷键打断,使嘌呤脱下,并使去氧核糖C-1位置释放醛基与席夫试剂反应显紫红色。细胞中只有DNA才具有这种专一的孚尔根反应,因此利用孚尔根反应,可以鉴定DNA的存在。并广泛应用于核及染色体的研究中。
实验注意
固定剂中,以OsO4和Carnoy效果较好,OsO4(1%或0.5%)是Feulgen反应的理想固定剂,只是因OsO4价钱较贵,故一般多采用Carnoy固定液。在Feulgen反应中,不能单独使用Bouin定液,因为它是Feulgen反应的最坏固定剂,但经Aller改进后的Bouin-Aller固定液效果却较好。上海创赛科技提供乙醇胺(色谱固定液,30℃),Ethanolamine,141-43-5,商品编号:C84-103805-100ml,价格170.5元。
Feulgen反应通常用稀酸进行水解,但水解的时间一定要适当。如水解时间不够, 反应就会变弱;如水解时间过长或水解地过于剧烈,则脱氧核糖也易掉下来,反应也会减弱。适当的水解时间一般为8~12min。但是水解时间长短也要视标本的类型(如厚薄等)、固定剂的性质以及酸的浓度而定。
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