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DNA片断化检测

教育装备采购网 2016-09-23 11:06 围观284次

  细胞凋亡时主要的生化特征是其染色质发生浓缩, 染色质DNA在核小体单位之间的连接处断裂, 形成50~300kbp长的DNA大片段, 或180~200bp整数倍的寡核苷酸片段, 在凝胶电泳上表现为梯形电泳图谱(DNA ladder)。细胞经处理后,采用常规方法分离提纯DNA,进行琼脂糖凝胶和溴化乙啶染色,在凋亡细胞群中可观察到典型的DNA ladder。如果细胞量很少,还可在分离提纯DNA后,用32P-ATP和脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT)使DNA标记,然后进行电泳和放射自显影,观察凋亡细胞中DNA ladder的形成。

  1. 大分子染色体DNA片段的测定

  细胞凋亡的早期,染色体断裂成为50~300kbp长的DNA大片段。所有超过一定分子量大小的双链DNA分子在琼脂糖凝胶中的迁移速度相同。线性DNA的双螺旋半径超过凝胶半径时,即达到分辨力的极限。此时凝胶不再按分子量的大小来筛分DNA,DNA像通过弯管一样,以其一端指向电场一极而通过凝胶,这种迁移模式称之为"爬行"。因此,细胞凋亡早期产生的50~300kbp长的DNA大片段不能用普通的琼脂糖凝胶电泳来分离。通常采用脉冲电泳技术可圆满地解决这一问题。这个方法是在凝胶上外加正交的交变脉冲电场。每当电场方向改变后,大的DNA分子便滞流在爬行管中,直至新的电场轴向重新定向后,才能继续向前移动。DNA分子量越大,这种重排所需要的时间就越长。当DNA分子变换方向的时间小于电脉冲周期时,DNA就可以按其分子量大小分开。

  2.DNA Ladder 测定

  方法:

  ①收获细胞(1X107)沉淀;

  ②细胞裂解液:13000rpm′5min, 收集上清;

  ③1%SDS和RnaseA(5mg/ml)56°C, 2h;

  ④蛋白酶K(2.5mg/ml)37°C,2h;上海创赛科技提供39450-01-6,蛋白酶K,Proteinase K,用于分子生物学,≥30 units/mg protein ,商品编号:C16-P10706-25mg,价格165元。

  ⑤1/10体积3M醋酸钠和2.5倍体积的冷无水乙醇沉淀DNA,4°C过夜?14000rpm′15min;上海创赛科技提供4418-26-2,脱氢醋酸钠,99% ,商品编号:D16-1019891-100g,价格155元。

  ⑥最后将沉淀溶解在TE buffer中,加DNA Loading Buffer;

  ⑦1.2%琼脂糖凝胶电泳,EB染色并照相。

  3.凋亡细胞DNA含量的流式细胞计分析

  方法:

  ①收集细胞,70%冷乙醇(in PBS)4°C固定过夜,PBS洗涤;上海创赛科技提供重组人 RNase A,Ribonuclease A,RNASE1 蛋白 (His 标签),Ribonuclease, RNase A family, 1 (pancreatic) Protein,商品编号:C86-134-68-50ug,价格2210元。

  ②1000rpm′10min RNase A(0.5mg/ml)37°C消化30min PI(50mg/ml)染色,室温避光15min;上海创赛科技提供957054-30-7,GDC-0941GDC0941>98%,有效的PI3Kα/δ抑制剂 ,商品编号:C84-4843-10mg,价格931元。

  ③FACScan分析DNA亚二倍体的形成及细胞周期的变化。

  4. ApoAlertTM LM-pcr Ladder Assay (CLONTECH)

  优点:敏感度高,适合于检测少量样本,小部分凋亡细胞。如临床活组织检测。

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