防腐剂是化妆品工业中非常重要的部分。随着化妆品种类和剂型的繁多, 及高科技生物原料应用的增加, 许多化妆品公司都在积极研究防腐剂问题( 包括其品种和使用浓度) , 并不断建立新的防腐体系。在评价防腐剂的实际效果中, 应用最为广泛和经典的研究手段是微生物挑战性试验(m icrob ialchallenge test ing)。这种测试方法是根据化妆品生产和消费者使用中可能存在的污染(一次污染和二次污染) , 人为地将一定量的微生物(细菌和霉菌) 加入到产品中, 然后间隔一定时间分析该产品中防腐剂对微生物的作用, 按检测期间加菌产品的含菌量来评判防腐剂的防腐效果与否或大小, 这种方法在评价防腐剂防腐效果上有很高的参考价值。
一、材料与方法
1、化妆品中常用的防腐体系
选择了8 种化妆品中常用的防腐体系按常规方法加入膏霜内, 同时设2 个对照膏霜(不含任何防腐剂)。防腐体系1 是011% 国产菌霉克星; 体系2 是011% 国产菌霉克星、012% 尼泊金甲酯、011% 尼泊金丙酯; 体系3 是0104% 国产CY21; 体系5 是国产CY21、012% 尼泊金甲酯、011% 尼泊金丙酯; 体系5是传统的尼泊金甲酯和丙酯与极美Ê 配伍; 防腐体系6、7 和8 是含同种防腐剂, 体系6 为低浓度, 体系7是高浓度, 体系8 是高浓度与其它防腐剂配伍。上海创赛科技提供尼泊金甲酯，对羟基苯甲酸甲酯,Methylparaben,>99%,USP，99-76-3,商品编号：C84-2041-25G，价格140元。
2、微生物挑战性实验
①受试用微生物
细菌包括: 大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、巨大芽胞杆菌、绿脓杆菌。霉菌包括: 黑曲霉、黄曲霉、变色曲霉、桔青霉、拟青霉、腊叶芽枝霉、球毛壳霉、绿色木霉
实验前, 将各菌种接种于合适的培养基中, 于37℃ (细菌) 或28℃(霉菌) 下培养。细菌培养在2 天后, 霉菌培养在5 天后, 挑选适量菌落于灭菌的生理盐水中, 制成一定浓度的混合细菌(1×108 个ömL ) 或混合霉菌悬液(1×107 个ömL ) , 置于4℃贮放备用。上海创赛科技提供7220-81-7，黄曲霉毒素B2(>98%,BR)，Aflatoxin B2，商品编号：C84-0627-1 mg，价格1482元。
②一次加菌的28 天微生物挑战试验
称取各受试样品30g,加入混合细菌或混合霉菌悬液, 每克受检膏霜最终含菌量分别为5×106 个细菌和3×105 个霉菌。然后充分混匀, 置于28℃下。在接菌的0、7、14、21 和28 天取样分析: 准确称取3g 样品, 加到含有玻璃小珠的灭菌锥形瓶内, 加入27mL 灭菌生理盐水, 充分震荡混匀, 此悬液为1∶10 稀释液; 然后再用灭菌生理盐水按10 倍依次稀释。按平板倾注法计数受试品中含菌量, 细菌培养是37℃下24h～ 48h, 霉菌培养为28℃下3～ 5 天。此实验用以评判防腐剂的有效与否。上海创赛科技提供94-13-3，尼泊金丙酯，GCS，商品编号：D16-1010228-5ml，价格98元。
评判标准为: 当每克样品中一次接菌(1×106 细菌和1×105 霉菌) 后, 在第14 天存活菌量减少至不高于起始浓度的011% , 以后逐渐减少, 在28 天为0。符合标准为防腐剂有效(通过测试) , 不符合为防腐剂无效(不通过测试)。上海创赛科技提供MUG快速检定大肠杆菌试剂，BR ，商品编号：D16-1024759-250g，询价。
③重复3 次加菌的微生物挑战试验
此方法参照国际CTFA (国际化妆品、香精和洗涤剂协会) 推荐的微生物挑战性试验。称取受试样品30g, 每隔2 周加菌一次(即实验的第1、3 和5 周) , 每次加细菌量为1×106～ 1×107 个ög 样品和霉菌1×105 个ö g～ 1×106 个ög 样品。在加菌后的0 天、7 天和14 天(后一次加菌前) 采样分析样品中含菌量, 方法同前。此方法可将受检样品分为三类:
(1) 防腐效果优良(W ) , 即三次加菌后, 在每次加菌后的第7 天或14 天时, 存活菌量减少至不高于起始浓度的0101% (即≤100 个ög 或mL 样品, 通过测试)。
(2) 防腐效果尚可(M ) , 即三次加菌后, 在每次加菌后的第7 天或14 天时, 存活菌量减少至不高于起始浓度的011% , (即≤1000 个ög 或mL 样品, 通过测试)。
(3) 防腐效果差(P) , 即三次加菌后, 在每次加菌后的第7 天或14 天时, 存活菌量> 1000 个ög 或mL 样品(不通过测试)。
二、结果
从结果看, 两种加菌方法对防腐体系的评判结果基本一致, 三次加菌还可对有效的防腐体系作出程度之区别: 防腐优良(W:W ell p reservat ive) 和防腐尚可(M :M arginal p reservat ive)。此外, 在一次加菌后1～ 2 周内能将样品中含菌量降低至加入菌量的011% , 可通过3 次加菌实验, 如防腐体系5 和8 对细菌的防腐力; 但若大于011% , 即使在以后的测试时间内有逐渐下降至0 的趋势, 可能亦很难通过3 次加菌实验,如防腐体系7 对细菌的防腐力。
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