步骤:
1. 前一天下午做好所需数量的Feeder细胞板;
2. 提前半小时左右将培养基从4℃冰箱取出,放于室温(或者放于37℃温箱内);
3. 将ES细胞培养皿、Feeder细胞培养皿从培养箱内取出(相差显微镜下作常规观察,Feeder细胞应生长良好,细胞覆盖95%左右,至少90%以上的培养皿面积);ES细胞应生长良好,接近长满培养皿,细胞集落大小一致、疏密均匀,集落形状规则、呈椭圆形、边缘光滑、表面光滑,细胞生长致密、核大、胞质少;上海创赛科技提供6.0CM一次性细胞培养皿,平底灭菌,适合细胞贴壁生长 ,商品编号:C81-TCD010060-600个/箱,价格652.5元。
4. 将ES细胞培养皿内的液体吸出、弃去,用PBS 1 mL左右洗一遍,加入胰蛋白酶溶液,作用约30秒,小心吸出胰蛋白酶溶液,弃去;再作用1—5分钟,不时观察,待细胞层(皿底一层白色脏东西样膜)出现裂缝并明显开始下滑时,补加培养基,适度吹打(视消化程度及管口粗细而定,至看不到明显的大的细胞团块为止);平均分到Feeder培养皿中(滴加,以免将Feeder细胞吹脱落下来),滴加补加培养基至5 ml左右(滴加,以免将Feeder细胞吹脱落下来;若为3.5cm培养皿,则补加至3ml左右),作好标签;上海创赛科技提供E30-LW300LT生物显微镜 ,商品编号:E30-LW300LT生物显微镜,询价。
5. 前后左右水平晃动培养皿,使ES细胞均匀分布于培养皿中,放入培养箱继续培养。
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