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规范操作 避免PCR反应污染方法

教育装备采购网 2016-11-16 09:58 围观700次

  PCR反应常见的污染表现为:标本间交叉污染,PCR试剂污染、PCR扩增产物污染以及实验中兊隆质粒的污染。为了有效地避克这些污染,使得实验的结果更准确、更直观:

  1. 合理分隔实验室

  将样品的处理、配制PCR反应液、PCR循环扩增及PCR产物的鉴定等步骤分区或分室进行,特别注意样本处理及PCR产物的鉴定应不其他步骤严格分开。最好能划分出标本处理区、PCR反应液制备区、PCR循环扩增区。各区的实验用品及吸样枪应与用,实验前应将实验室用紫外线消毒以破坏残留的DNA或RNA。

  2. 预混和分装PCR试剂

  所有的PCR试剂都应小量分装,如有可能,PCR反应液应预先配制好,然后小量分装,-20℃保存。以减少重复加样次数,避克污染。另外,PCR试剂,PCR反应液应于样品及PCR产物分开保存,不应放于同一冰盒或同一冰箱。

  3. 设立适当的阳性对照和阴性对照

  阳性对照以能出现扩增条带的最低量的标准病原体核酸为宜,注意交叉污染的可能性,每次反应都应有一管不加模板的试剂对照及相应不含有被扩增核酸的样品作阴性对照。

  4. 防止RNA酶污染

  首先,所有的玱璃器皿均应在使用前亍180℃的高温下干烤6hr或更长时间;其次,塑料器皿可用0.1%DEPC水浸泡活用氯仿冲洗(注意:有机玱璃器具因可被氯仿腐蚀,故丌能使用),幵丏,有机玱璃的电泳槽等,可先用去污剂洗涤,双蒸水冲洗,乙醇干燥,再浸泡在3%H2O2室温10min,然后用0.1%DEPC水冲洗,晾干;再者,配制的溶液应尽可能的用0.1%DEPC,在37℃处理12hr以上。然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂,应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制,然后经0.22μm滤膜过滤除菌。

  5. 实验人员规范的操作

  RNA操作过程中,实验人员应佩戴一次性口罩、帽子、手套(不含荧光物质),试验过程中手套要勤换,使用一次性移液枪吸头(带滤嘴自卸式),设置RNA操作与用实验室,所有器械等应为与用;上海创赛科技提供epIIPS 独立包装 50-1000ul,生物纯级 吸头,100个/包,现货,商品编号:C55-0030010035,价格391元。

  使用超净工作台(负压式)或防污染罩进行试剂准备和标本处理,以防止对环境的污染。

  最好在每次实验前后都要对操作台、移液器、离心机、PCR扩增仪等仪器设备用10%次氯酸或75%乙醇擦拭消毒。

  废弃物、有害有毒的标本及试剂应妥善放置及与人处理。

  移液枪的使用方法,所有的液体都要缓慢加至管底,不要加至管壁,使用振荡器混匀体系,不能用移液器吹打。

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