教育装备采购网
河南大学体育论坛580*60 第六届图书馆论坛580*60

H-胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)渗入法实验步骤

教育装备采购网 2016-11-22 10:16 围观1421次

  一、操作方法

  1、培养液中按1%的体积加双抗(含青霉素1万U/ml,链霉素0.01g/ml)及肝素液(含肝素100U/ml)。用3.5%NaHCO3液调pH值为7.2~7.4,然后加灭活的小牛血清,使浓度为20%。再加PHA(50U~75U/ml),无菌分装于培养瓶内,每瓶1ml。上海创赛科技提供57-92-1,链霉素(标准品)Streptomycin,商品编号:C84-9623-200mg,价格77元。

  2、无菌操作采血,并以肝素抗凝,同时进行白细胞计数及分类计数。

  3、取0.1ml抗凝血,加入到含1ml培养液的培养瓶中,每个血样接2~3个培养瓶。如果以血浆或分离的淋巴细胞代替全血,加入培养瓶中更好。上海创赛科技提供人抗凝血酶3Elisa试剂盒,Human Antithrombin III,AT III ELISA Kit,商品编号:LH-E10215HU-96T,价格1700元。

  4、37℃培养72h,在培养结束前16h~24h,每瓶加入3H-TdR 1uci。

  5、培养结束后,将培养物移到离心管内,用3%冰醋酸6ml,分两次冲洗培养瓶,并将冲洗液也装入离心瓶中,2 000r/min离心10min,去上清。沉淀再用3%冰醋酸洗涤一次,同样离心去上清。

  6、在沉淀中加30%H2O2液一滴,85℃水浴15min,待溶液呈无色时,再加甲酸0.5ml,继续加热(85℃)30min,使沉淀物完全消化溶解。

  7、将消化溶解的液体移入测样杯内,用红外灯或80℃热空气烘烤至液体体积少于0.1ml,加闪烁液5ml,用液体闪烁液计数器测其脉冲数。上海创赛科技提供132-98-9,青霉素V钾,Penicillin V potassium salt,分析标准品,商品编号:C16-P11203-100mg,价格395元。

  8、第5~7步骤制备闪烁液样品也可以采用滤膜法制备。即:培养结束后,将培养液移入离心管,2000r/min离心10min,弃上清,沉淀用生理盐水洗涤一次、再离心。将沉淀移至滤膜上(注意将沉淀全部移入),减压抽滤,并依次以10ml生理盐水、5ml 5%三氯醋酸(若有带色物质,用30%H2O2液脱色)和3ml无水乙醇抽滤。取出滤膜,60℃~80℃烘干,然后将滤膜放入装有5ml的闪烁液中(贴细胞的面朝上),用液体闪烁液计数器检测。

  二、结果判定

  以液体闪烁计数器测定每分的脉冲数cpm。取各管测定读数的平均值,即为0.1ml血样的脉冲数。全血检测的脉冲数,再按血样淋巴细胞计数结果,校正成每百万淋巴细胞的脉冲数(cpm/106淋巴细胞)。也可以刺激指数(SI)表示试验结果。为此须在培养时,设同样数量的不加PHA的对照培养瓶,试验管脉冲数与对照管脉冲数之比,即为刺激指数。

  三、注意事项

  1、血样与培养基比例一般在1:10~1:30为宜。

  2、培养细胞时,可放入CO2培养箱中培养,也可在普通温箱进行培养,但一定要把盖子拧紧,否则结果差别较大。

  3、以SI表示结果时,一定要设置相同数量培养管的对照(即不加PHA)。而以cpm绝对值表示(cpm/106淋巴细胞)则可以不用设对照管。因为对照的cpm与本底比较接近,不同样品之间的少许差别也不易确定其意义。

  4、闪烁液的容水量很低,所以在加入闪烁液之前必须烘干。但加入一定量的醇类(如无水乙醇),则可容纳少量的处理后所残留的水分,但也仍需烘至接近干燥的程度,否则将发生浑浊而无法测定。据报道,如果闪烁液中加入1/3的异辛基苯氧聚乙氧乙醇(TritonX-100),其容水量可达15%,消化溶解后的样品,不必烘干,即可添加闪烁液测定。

  上海创赛科技性能卓越,白介素细胞因子,胎牛血清,电泳设备科学仪器,原料药标准品,化学试剂,细胞培养耗材,上海创赛,海量产品特价促销中,欢迎来电咨询!

点击进入上海创赛科技有限公司展台查看更多 来源:教育装备采购网 作者:上海创赛科技有限公司 我要投稿
校体购终极页

相关阅读

版权与免责声明:

① 凡本网注明"来源:教育装备采购网"的所有作品,版权均属于教育装备采购网,未经本网授权不得转载、摘编或利用其它方式使用。已获本网授权的作品,应在授权范围内使用,并注明"来源:教育装备采购网"。违者本网将追究相关法律责任。

② 本网凡注明"来源:XXX(非本网)"的作品,均转载自其它媒体,转载目的在于传递更多信息,并不代表本网赞同其观点和对其真实性负责,且不承担此类作品侵权行为的直接责任及连带责任。如其他媒体、网站或个人从本网下载使用,必须保留本网注明的"稿件来源",并自负版权等法律责任。

③ 如涉及作品内容、版权等问题,请在作品发表之日起两周内与本网联系,否则视为放弃相关权利。

九牧