1.琼脂糖电泳
(1)取一定量的待测DNA样品，用适当的限制性内切酶酶切。DNA的量根据样品的种类及
实验目的的不同而异，对于克隆片段的限制性内切酶图谱分析，取0.1-0.5μg即可;而对于鉴
定基因组DNA中的单拷贝基因序列，则需要10～20μg;当采用寡核苷酸探针或探针的比放射
性活性较低时，则需要30～50μg。
(2)酶切完毕，在琼脂糖凝胶中电泳。
(3)电泳结束后，EB染色，长波紫外线下观察电泳结果及照相。
2.印迹转移
(1)切胶并作标记(左下角切除)，以便于定位，然后将凝胶置于一容器中。
(2)将凝胶浸泡于适量的变性液中，室温下放置1h 使之变性，不间断地轻轻摇动。
(3)将凝胶用去离子水漂洗1次，然后浸泡于适量的中和液中30 min，不间断地轻轻摇动。更换中和液，继续浸泡15 min。
(4)将滤纸，NC膜剪成与胶同样大小，NC膜浸入转移buffer 中平衡30 min。
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(5)按图操作：逐层铺平，各层之间勿留有气泡和皱折。
(6)虹吸转移12-16h。
3.固定DNA
(1)取出转移后的NC 膜，用滤纸吸干NC 膜，NC 膜光面朝上平铺于变性液中变性5min。
(2)用相同的方法将NC膜平铺在中性液上，中和两遍，每遍5min。
(3)将膜夹在两张干燥滤纸间，80℃烘烤1-2h。
4.预杂交
(1)将膜浸入5×SSC 中 2min，将膜放入干净的塑料袋中。
(2)将预杂交液事先在65℃ 预热，然后将10 ml 预杂交液加入袋中，封口。
(3)65℃预杂交1h 以上，不时摇动。
5.杂交
(1)取出杂交袋，剪去一角去除杂交液后，加入5ml 杂交液及5μl 变性探针，排除气泡后封口。
(2)将杂交袋放入65℃ 水浴中杂交过夜。
6.按下列条件洗膜
2×SSC, 0.1%SDS 50ml 室温5min /2 次
0.1×SSC, 0.1%SDS 50ml 65℃ 15min /2 次
7.免疫酶联检测
(1)偶联反应
①用中和液洗膜2min，室温。
②用封闭液50ml 洗膜30min，室温，轻摇。
③用中和液将稀释抗体-Dig –Ap 至 750 mU/ml ，将膜封入杂交袋，加入5 ml稀释抗体轻摇50min。
④用中和液50 ml 洗膜，10min ×2 次，室温，轻摇，除去未结合的抗体。
(2)显色反应①用平衡液20 ml平衡膜2min。
②将膜装入杂交袋中，加入5ml 显色液，避光30min 左右，当出现颜色时不要晃动。
③用TE洗膜终止反应。
④80℃烤干。
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